腺病毒介導的RNA干擾ERCC1基因表達對卵巢癌順鉑化療的增敏作用

田麗娜，瞿全新，盛曉濱，徐福強

卵巢癌在所有婦科腫瘤中發病率最高，危害較大。順鉑是卵巢癌化療的一線藥物，在卵巢癌綜合治療中占有重要地位。目前普遍認為，DNA損傷是癌癥發病的重要機制，順鉑細胞毒作用主要是形成鉑-DNA加合物，ERCCl基因是DNA損傷修復途徑的關鍵基因，其表達升高與卵巢癌順鉑耐藥的發生密切相關。RNA干擾能夠作為一種簡單、有效地代替基因敲除的遺傳工具，哺乳動物中起作用的是小干擾RNA(siRNA)，在卵巢癌細胞中成功調控ERCC1基因表達，hTERT啟動子作為腫瘤特異性啟動子已經被廣泛用于靶向轉錄基因治療研究中，本實驗采用5型腺病毒基因重組而成的腺病毒載體，通過RNA干擾技術阻斷ERCC1基因的表達來增強卵巢癌細胞的DDP敏感性，為基因治療克服卵巢癌耐藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株SKOV3，由天津醫科大學免疫學試驗室提供。

1.1.2 相關試劑及耗材 注射用順鉑(凍干型)：齊魯制藥廠(批號H20023461)。重組腺病毒：Ad-hTERT-ERCCl-siRNA及只包含ERCC1啟動子的重組腺病毒Ad-hTERT由本研究小組前期合成[1]。RPMI-1640培養基：天津圣東生物科技發展公司(批號BW12014)。小牛血清：中美合資蘭州民海生物工程有限公司(批號200110203)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養條件 卵巢癌細胞株SKOV3細胞用含10%牛血清的RPMIl640培養液培養，在37 ℃、5%CO2、相對濕度90%的培養箱中培養，細胞為貼壁生長細胞，按1∶2或1∶3傳代。

1.2.2 藥物配置 順鉑用生理鹽水配成1 mg/ml的貯存液，腺病毒置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 臺盼藍排斥試驗 取2×104/ml的SKOV3細胞接種于24孔板，每孔l ml，根據臺酚藍試劑盒染色操作方法，每隔24 h染色3個孔內細胞，計數活細胞數, 求平均值，連續計數7 d，繪制細胞生長曲線。根據阮和云等[2]的實驗方法計算細胞倍增時間。

1.2.4 MTT法測定SKOV3細胞順鉑IC50值 實驗組取對數生長期SKOV3細胞，經消化后以4.4×104/ml的細胞濃度加入到96孔板中，每孔180 pl。培養24 h后，順鉑(DDP)等比稀釋后分別加入96孔板中，分為6個濃度，其終濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μg/ml。每一濃度設4個平行孔，同時設立陰性對照組(只含等體積細胞懸液，不加藥物)、空白調零孔(只含等體積完全培養基，不加藥物)。培養72 h后，MTT法測573 nm處OD值。順鉑對SKOV3細胞的抑制率=[1-(實驗組OD-空白調理組OD)/(陰性對照組OD-空白調零組OD)]×100%。實驗重復3遍，取平均值。根據劉國艷等[3, 4]的方法計算IC50。

1.2.5 MTT法測定不同感染復數的腺病毒對SKOV3細胞的影響 實驗組取對數生長期SKOV3細胞，經消化后以8×104/ml的細胞濃度加入到96孔板中，每孔100 μl。培養24 h后，分別用0、1、10、20、30、40、50、60、70感染復數(multiplicity of infection, MOI)的重組腺病毒感染細胞，設4個復孔，同時陰性對照組按照上述方法加入腺病毒(Ad-hTERT)。培養2 d后，MTT法測573 nm處OD值。腺病毒對SKOV3細胞生長的抑制率=(1-實驗組OD值/MOI 0組OD值)×100%。實驗重復3遍，取平均值[3, 5]。

1.2.6 MTT法測定不同感染復數腺病毒對SKOV3細胞順鉑IC50值的影響 實驗組取對數生長期SKOV3細胞，經消化后以8×104/ml濃度加入到96孔板中，每孔100 μl。培養24 h后，分別用l、10、50、80感染復數的重組腺病毒感染細胞，每孔180 μl。同時陰性對照組(只含等體積細胞懸液，不加藥物)、空白調零孔(只含等體積完全培養基，不加藥物)。每組設24個復孔。12 h后，每組細胞分別加入不同濃度DDP，每組最終設4個復孔。培養72 h，計算不同感染復數腺病毒作用下SKOV3順鉑IC50值。實驗重復3遍，取平均值。

1.2.7 細胞凋亡的形態學觀察 取1×105/ml濃度、對數生長期SKOV3細胞，每孔500 μl接種于24孔板內，培養24 h后，分別用1、10、50、80感染復數的腺病毒感染細胞，同時陰性對照組(只含等體積細胞懸液，不加病毒)。每一感染復數設2個復孔，分為2組。培養4 h后，其中一組細胞加入順鉑，調整終濃度為4 μg/ml，培養24 h后，按照Hoechst試劑盒方法固定染色[5]，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復3遍。

1.2.8 流式細胞技術測定DDP及不同濃度腺病毒作用的細胞周期與凋亡 將生長良好的SKOV3細胞，以1.6×105/ml濃度6 ml傳代至新培養瓶中，共11瓶，培養24 h后，加入治療藥物，分組方法為：(1)Ad-HTERT-ERCCl-siRNA組，添加重組腺病毒MOI 0、1、10、50、80；(2)病毒聯合順鉑組，在(1)的基礎上添加終濃度為4 μg/ml的順鉑；(3)空載體病毒(Ad-HTERT)聯合順鉑組，在順鉑終濃度為4 μg/ml的基礎上添加空載體病毒MOI 50。以上各組細胞培養24 h后終止，收集細胞處理后，按流式細胞試劑盒操作方法，測定細胞凋亡和周期分布[6]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，生長曲線圖采用折線圖方法繪制，回歸方程及IC50值采用回歸分析計算，均數比較采用單因素方差分析。順鉑濃度與抑制率關系及腺病毒濃度與細胞對順鉑的敏感性關系采用相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SKOV3細胞培養 SKOV3細胞培養前5 d逐漸增多，5 d后趨于平緩(圖1)。

圖1 SKOV3細胞生長曲線及形態

A.對數生長期細胞生長曲線;B.SKOV3細胞對數生長期形態(臺酚藍，×400)

2.2 順鉑和腺病毒對SKOV3細胞的影響 SKOV3細胞給予順鉑處理后，隨著順鉑濃度的增加，SKOV3細胞的存活數量進行性下降，細胞抑制率逐漸升高，順鉑濃度與SKOV3細胞抑制率呈線性正相關(圖2，A)，相關系數r=0.9905(P<0.05)，順鉑IC50值為(7.76±0.37)μg/ml。而SKOV3細胞給予腺病毒處理后，對照組(Ad-HTERT)SKOV3細胞的存活數量無明顯改變。而實驗組中，隨著感染復數的逐漸增加，SKOV3細胞的存活數量逐漸減少，細胞抑制率逐漸升高(圖2，B)，兩組間具有統計學差異(P<0.05)。

圖2 順鉑和腺病毒對SKOV3細胞的影響

A.順鉑對SKOV3細胞的抑制率;B.對照組與試驗組對SKOV3細胞抑制率

2.3 腺病毒對SKOV3細胞順鉑敏感性的影響 對照組中SKOV3在感染了空載體腺病毒(Ad-HTERT)后，IC50無明顯變化(圖3A)。對順鉑的敏感性無明顯增加(圖3B)。實驗組中SKOV3細胞在感染了抑制ERCCl基因表達的腺病毒后，IC50進行性下降，并且呈濃度相關性(r=0.9943，P<0.05)(圖3A)。SKOV3細胞對順鉑的敏感性隨病毒濃度的增加而增加，分別增加了9.4%(t=5.060，P<0.05)、16.4%(t=10.763，P<0.05)、23.2%(t=23.175，P<0.05)、33.5%(t=16.809，P<0.05)(圖3B)。

圖3 腺病毒對SKOV3細胞順鉑敏感性的影響

A.兩組病毒感染SKOV3細胞后DDP的IC50變化；B.對照組與試驗組對SKOV3 DDP敏感性的影響

2.4 細胞凋亡和周期測定 本實驗測得SKOV3細胞G1、S和G2/M期細胞分別為28.12%、58.02%和13.87%，凋亡率為15.34%(圖4和圖5A)。

對于SKOV3細胞，不同感染復數的Ad-HTERT-ERCCl-siRNA感染SKOV3細胞后，細胞周期左移，G1期比例增加，S期比例減少，G2/M期比例減少，細胞凋亡率有所增高(圖4、5)。

單純順鉑作用組的細胞周期明顯右移，G1期細胞比例減少, S期細胞比例增高，G2/M期比例減少，細胞凋亡率增高，結果均具有統計學差異(P<0.05)。Ad-HTERT-ERCCl-siRNA聯合順鉑作用下，細胞周期變化與單純順鉑作用組相似，細胞凋亡率最高達對照組的2.66倍(40.76/15.34)，結果均具有統計學差異(P<0.05)(圖4、5)?？蛰d體病毒(Ad-hTERT)聯合順鉑作用下，與單獨順鉑治療組相比，細胞周期分布相近，細胞凋亡率無明顯改變(圖6)，結果無統計學差異。

圖4 單純順鉑作用組與對照組SKOV3細胞不同細胞周期比例及凋亡率 A.G1期細胞比例;B.S期細胞比例; C.G2/M期細胞比例; D. 凋亡率

圖5 Ad-HTERT-ERCCl-siRNA聯合順鉑作用流式細胞結果

A.正常SKOV3細胞;B. 重組腺病毒MOI 1; C. 重組腺病毒MOI 10; D. 重組腺病毒MOI 50; E. 重組腺病毒MOI 80; F.DDP 4 μg; G. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 1; H. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 10; I. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 50; J. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 80

圖6 空載體病毒聯合順鉑與單獨順鉑治療組SKOV3細胞凋亡率

3 討 論

順鉑是一種臨床常用的腫瘤化療藥物，已經使用了近30年，可以抑制多種人類腫瘤[7]。順鉑的細胞毒作用主要是形成鉑-DNA復合物，鉑-DNA復合物能阻礙DNA的模板作用，抑制DNA的復制和轉錄，導致DNA的斷裂和錯誤編碼[8, 9]。順鉑等抗癌藥物引起的DNA損傷主要通過NER途徑修復，腫瘤細胞的順鉑敏感性與DNA損傷修復能力有關[10]。核苷酸切除修復是正常的細胞針對DNA鏈上較大損傷的主要修復過程，是清除鉑類藥物所致的DNA螺旋扭曲的主要機制，在NER過程中，鉑類耐藥的最為關鍵的因子是ERCC1[11]，也是目前研究較多的DNA修復基因之一。ERCC1位于人類19號染色體上，參與了DNA鏈的切割和損傷識別。體內和體外研究表明，ERCC1的mRNA或者蛋白質表達水平的升高于卵巢腫瘤、膀胱腫瘤、消化道腫瘤、乳腺癌及肺癌等多種腫瘤的耐藥性及化療反應性密切相關[12-16]。因此針對DNA損傷修復途徑采取策略為降低細胞的DNA損傷修復能力，可以增加腫瘤細胞的藥物敏感性[17, 18]。

本試驗采用本實驗室前期合成的攜帶hTERT啟動子的重組腺病毒載體感染卵巢癌細胞SKOV3，MTT實驗結果表明空載體病毒對細胞生長無明顯抑制作用，而重組腺病毒載體具有抑制細胞生長的作用，具有劑量依賴性，通過觀察細胞形態變化發現，與正常細胞和空載體病毒組細胞相比，重組腺病毒載體感染的細胞變圓，體積稍大，細胞間的連接較疏松。提示抑制ERCCl基因表達，使腫瘤細胞生長受到一定的抑制，抑制率為1%～30%，表明ERCCl基因蛋白在維持腫瘤細胞生長中發揮一定的作用[1，3]。

通過體外藥敏試驗證實，感染空載體腺病毒的細胞IC50無明顯改變，腫瘤細胞對順鉑的敏感性無明顯增加，增加劑量后亦無明顯改變。重組腺病毒可增加SKOV3的順鉑敏感性，且隨著病毒感染復數的增加，腫瘤細胞殺傷作用增強。與感染空載體腺病毒的細胞相比，SKOV3細胞在感染了逐漸增加感染復數的重組腺病毒后，腫瘤細胞IC50逐漸下降，腫瘤細胞對順鉑的敏感性分別增加了9.4%、16.4%、23.2%、33.5%，提示重組腺病毒對SKOV3具有順鉑增敏作用，并且呈劑量依賴性。

流式細胞技術檢測單純重組腺病毒處理后，SKOV3細胞周期和凋亡率發生改變，G1期比例增大，S期比例減小，G2/M期比例減小，細胞凋亡率有所增高，表明腺病毒具有G1期阻滯和促進SKOV3細胞凋亡的作用，重組腺病毒聯合DDP處理SKOV3細胞后，與單純順鉑處理組相比，G1期細胞比例明顯減少，S期細胞比例明顯增加；G2/M期比例減少，細胞凋亡率顯著增高，表明重組腺病毒可通過調節DDP對SKOV3的S期阻滯及促進腫瘤細胞凋亡等途徑增強DDP的化療敏感性。而空載體病毒聯合順鉑作用下，與單獨順鉑治療組相比，細胞周期分布相近，不增加細胞凋亡。表明空載體病毒不影響順鉑對于SKOV3細胞周期的作用。

綜上所述，重組腺病毒可以增加順鉑對腫瘤細胞的殺傷作用，其機制可能為重組腺病毒通過抑制DNA損傷的NER途徑修復途徑，增加了順鉑的S期阻滯作用，增強了順鉑的細胞DNA損傷效果，并同時促進細胞凋亡。并且本實驗結果表明空載體腺病毒對于細胞周期及細胞凋亡無影響，是一種優良的基因載體。由此我們認為，以腺病毒為載體，以ERCCl為靶點進行基因治療可提高卵巢癌順鉑化療的敏感性，該方法可望成為提高卵巢癌化療療效的新方法。

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