水質葉綠素a的提取方法優化探討

劉丹

摘要：葉綠素a檢測是生物監測水質和評價藻類生物量的重要指標，但是從當前實際情況來看，水質中葉綠素a檢測方法存在研磨損失問題。文章總結分析了反復凍融法、超聲波法、熱乙醇法等改進方法，為如何優化水質中葉綠素a的提取方法進行策略分析。

關鍵詞：水質；葉綠素a；提取方法；優化分析

葉綠素a是地表水監測的常規項目，是評價水體初級生產力和水體富營養化的重要指標。目前環境監測實驗室主要采用的是《水和廢水監測分析方法》（第四版）（以下稱第四版）中《葉綠素a的測定方法—丙酮研磨提取法》和2017年12月21日環境保護部首次發布的《葉綠素a的測定 分光光度法 HJ 897-2017》。兩種方法都是采用研磨法作為提取方法，但在大量的實際研究工作中發現，研磨可能導致葉綠素a的損失。目前，已有研究對標準方法中葉綠素a提取方法進行優化改進，如：反復凍融法、超聲波法、熱乙醇法等[1-3]。本文就上述幾種提取方法的操作步驟、優缺點進行總結，為優化水質中葉綠素a檢測方法進行分析。

一、研磨浸提法

研磨的內涵是破碎的細胞壁在丙酮溶液的作用下能夠確保葉綠素a更容易被析出。HJ 897-2017規定，將樣品濾膜置于研磨器中，加入3～4ml丙酮溶液研磨至糊狀，并重復1～2次，保證充分研磨5min以上，在4°C避光浸提2～24h，離心取上清液，再用0.45μm聚四氟乙烯有機相針式濾器過濾上清液后測定。該方法在第四版的基礎上進行了改進，減少了多次研磨、轉移過程中樣品的損失。但仍存在手動研磨費時費力、人為誤差較大、研磨器表面附著等問題，不僅會造成葉綠素a提取不完全，長時間與有神經毒性的丙酮溶液接觸也不利于實驗人員身體健康。

二、反復凍融浸提法

反復凍融浸提法是利用細胞冰粒的形成和細胞液濃度的增高引起溶脹以達到破碎細胞的目的。反復凍融—浸提法操作步驟分為冰凍、解凍、浸提三步，將濾膜放入黑色塑料袋或用錫箔紙包好，在-20°C和室溫下反復凍融3～5次（冰凍時間為20min，解凍時間為5min），再放進10ml 90%丙酮溶液中震搖1min，4°C避光浸提20h后離心測定。

研究表明，反復凍融浸提法對葉綠素a的提取效果優于研磨浸提法[4]。不僅其有效減少了操作過程中樣品的損耗，而且在顯微鏡下觀察細胞破碎率達90%，明顯高于研磨法[5]。因此反復凍融浸提法所測得的濃度水平較高，平行樣品間的標準偏差也較小，重現性較好。同時，降低了試驗人員與丙酮的接觸時間。但反復凍融破碎的效果也因水體內藻類的不同而存在差異。陳明等發現，反復凍融—浸提法對微囊藻葉綠素a的提取效果優于小球藻[6]。這是因為前者細胞壁多由肽聚糖組成易破碎，而后者細胞壁中含有大量纖維組織，穩定性好，較難破碎。同時，該方法在實驗過程中對濾膜的水分含量和反復凍融時間的掌握也尤為重要[7]。

三、超聲波提取法

超聲波提取法就是利用超聲波的能量起到破碎細胞的作用。操作方法較為簡單，即將濾膜置于有90%丙酮溶液的離心管中，于超聲波儀破碎30min，然后定容、離心、待測。實驗結果表明，超聲波提取法測定所得的葉綠素a濃度水平是研磨提取法的1.08～1.57倍，提取效率明顯提高[3]。同時，該方法也具有安全性高、系統操作誤差小的優點。然而，與反復凍融—浸提法相似的是，該方法的提取效果也易受藻類細胞壁結構的影響[6]。

四、熱乙醇浸提法

熱乙醇浸提法在操作過程用安全的乙醇替代揮發性強的丙酮，在國際上采用率較高。該方法的原理是利用冷凍再熱融過程引起細胞溶脹破碎，同時加熱升溫以增加乙醇萃取能力，從而使葉綠素a提取的更充分。操作步驟為將冷凍后的濾膜置于比色管中，迅速加入7～8ml 95%的熱乙醇振搖，并水浴萃取1～2min，浸提后定容、離心測定。

研究發現，熱乙醇浸提法對綠藻為主的水體中葉綠素a的提取效果較好，甚至優于反復凍融浸提法和超聲波浸提法[6]。但也有研究表明熱乙醇浸提法測得的葉綠素a含量與研磨浸提法所測數據無顯著差異[3，8]。該方法優勢在于樣品損失小、安全性高，操作簡單。然而，實驗過程中，水浴的時間和溫度控制尤為重要。溫度過高，乙醇蒸發、葉綠素a的穩定性被破壞均會使實驗結果偏低；溫度過低則會造成提取不完全，使結果偏低。楊玉珍等在對水浴溫度、浸提溫度、浸提時間等實驗條件進行比較優化后提出，抽濾后濾膜先冷凍8h以上，然后在80°C條件下水浴萃取，室溫浸提12h以上提取效果更好[2]。也有學者認為90%丙酮比95%乙醇的穿透性更強、萃取效率更高，更能完全提出浮游植物的葉綠素a[8]。

結論：

綜上所述，葉綠素a提取方法的改進主要是解決研磨過程中樣品損失的問題。研究人員提出的反復凍融法、超聲波法和熱乙醇法改進策略操作簡便、安全性高、重復性好、人為誤差小，提取效果較好，但在實際操作過程中時間、溫度、藻類種類等客觀因素對葉綠素a的提取效果影響較大。因此針對不同的水體、不同實驗條件選擇或組成最佳的葉綠素a的提取方法可達到客觀反映水體初級生產力和水體富營養化的目的。

參考文獻

[1]黃瑩波.浮游植物葉綠素a提取方法的改進：反復凍融-浸提法[J].中國科技信息，2012（10）：157-157.

[2]楊玉珍，夏未銘，楊瑾，等.水體中葉綠素a測定方法的研究[J].中國環境監測，2011，27（5）：27-30.

[3]李征，胡新躍.水質中葉綠素a檢測方法的改進和探討[J].科技傳播，2016，8（12）.

[4]戴欣，楊航，石巖等.分光光度法測定水體中葉綠素a含量的改進[J].東北水利水電，2012，30（6）：32-33.

[5]韓彥霞，牟真.研磨法與凍融法測定湖庫葉綠素a的方法探討[J].中國水能及電氣化，2018（2）.

[6]陳明，孫潔梅，李敏.水體中藻類葉綠素a提取方法的比較[J].環境監測管理與技術，2017（4）.

[7]林少君，立靜，黃沛生等.浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進[J].生態科學，2005，24（1）.

[8]黃昌妙，葉樹才，王潮.浮游植物葉綠素a測定方法的比較分析[J].福建分析測試，2013，22（4）：23-27.

（作者單位：自貢市自流井區環境監測站）