Nodal及其受體在不同發育期小鼠組織器官中的表達*

王 軻,朱 敏,顧 洪,李念峰,胡湘麟,曾凡才△

(西南醫科大學：1.臨床醫學院； 2.康復醫學系；3.基礎醫學院生物化學與分子生物學實驗室，四川瀘州 646000)

Nodal生長分化因子(Nodal)作為轉化生長因子β(TGF-β)超家族的一員，是一種主要通過自分泌和旁分泌經細胞膜信號轉導發揮作用的細胞因子[1]。經典的Nodal信號通路為兩分子成熟形式Nodal先形成同源二聚體，然后與兩分子Ⅱ型受體ACTRⅡA或ACTRⅡB結合形成四聚體，再招募兩分子Ⅰ型受體激活素受體樣激酶4(activin receptor-like kinase 4,ALK4)或激活素受體樣激酶7(activin receptor-like kinase 7,ALK7)形成六聚體復合體，復合體中的Ⅱ型受體使Ⅰ型受體ALK4或ALK7被磷酸化后激活，同時Cripto-1分子可能作為輔助受體參與Nodal信號轉導作用[2]。激活的ALK4或ALK7可使細胞質內Smad2和Smad3分子發生磷酸化后轉位到細胞核以調節靶基因表達并發揮相應生物學效應[3]。

真核生物基因普遍存在選擇性剪接現象[4]。基因預測Nodal分子可能有兩種剪接異構體，不過目前為止僅檢測到一種剪接異構體蛋白，該剪接異構體蛋白有前體(Pro-Nodal)和成熟肽(Nodal)兩種形式。ALK7是Nodal分子已知的兩個Ⅰ型受體之一，ALK7通過選擇性剪接可產生4種剪接異構體，它們分別是：ALK7-1，ALK7-2，ALK7-3和ALK7-4[5]。ALK4是Nodal信號通路中的另一個Ⅰ型受體，剪接異構體主要有ALK4-1和ALK4-2。Nodal分子的輔助受體Cripto-1僅觀察到一種剪接異構體蛋白。

大量研究表明Nodal分子主要在動物體胚胎發育和體軸左右不對稱形成過程中發揮重要作用[6]。最近也有研究發現Nodal分子在多種惡性腫瘤中高表達，可能與腫瘤的發生和發展過程相關，并且認為其可能是腫瘤診斷的標志分子和治療靶點[7-9]。但是HOOIJKAAS等[10]卻提出由于Nodal在人腎臟組織中有較強表達，可能并不適于作為腫瘤免疫治療的靶點。由于人的正常組織器官不易獲取，目前還不十分清楚Nodal分子在其他正常組織器官中的表達情況，甚至也未見Nodal分子在動物組織器官中表達分布的相關報道；此外，雖然已知Nodal分子在早期胚胎發育過程有重要作用，但是還不清楚Nodal分子在個體發育后期是否也同樣發揮作用。本實驗基于上述兩個問題，以小鼠為動物模型，選取胎鼠、新生鼠、仔鼠、成年鼠4個不同發育時期小鼠，用Western blot方法檢測其多種器官中Nodal及其受體ALK7、ALK4和輔助受體Cripto-1蛋白的表達，以探討Nodal及其受體在不同生長發育時期的表達情況，為進一步研究Nodal分子功能及其是否可作為腫瘤免疫治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 昆明小鼠，5～6周齡，體質量26～30 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2主要儀器和試劑 SCIENTZ-Ⅱ型超聲細胞粉碎機(寧波新芝公司)，TGL-16R型低溫高速離心機(珠海黑馬公司)，Forma 900系列-86 ℃立式超低溫冰箱(Thermo公司)，DYCZ-24系列雙垂直蛋白電泳儀(北京六一儀器廠),GelDocXR+System(BIO-RAD公司)。苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液均購自碧云天研究所。0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore IPVH00010)、Nodal(sc-28913，Santa Cruz公司，1∶300)、ALK7(sc-135001，Santa Cruz公司，1∶300)、ALK4(ab64831，Abcam公司，1∶1 000)、Cripto-1(ab19917，Abcam公司，1∶1 000)、β-actin(BS6007M，Bioworlde公司，1∶10 000)。二抗：HRP標記山羊抗兔(BS13278,Bioworlde公司,1∶5 000)，HRP標記山羊抗鼠(BS12478,Bioworlde公司，1∶5 000)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 從新購進的20只小鼠(雌雄各10只)中選擇6只(雌雄各3只)分為3組直接取各組織器官提取蛋白作為成年鼠組樣品，其中雌鼠只取乳腺組織蛋白樣品，其余組織器官樣品均來自雄鼠。剩下的14只(雌雄各7只)小鼠在23 ℃環境下繼續飼養兩周以保證其充分性成熟。兩周后，下午6點左右將剩下的14只小鼠按雌雄1∶1合為7籠，次日早上將雌鼠和雄鼠分開，取3籠雌鼠標記為胎鼠組，3籠雌鼠標記為新生鼠組，1籠雌鼠標記為仔鼠組后繼續飼養。將雌雄鼠分開時記為孕0 d，飼養兩周后未見小鼠腹部明顯變大者繼續合籠。根據此方法，將3只孕鼠在孕第18天時做剖宮產，取出胎鼠并提取胎鼠各組織器官的蛋白樣品。將同一孕鼠的胎鼠組織收集在一起作為一組樣本，共收集到3組胎鼠組樣本；標記為新生鼠組的3只孕鼠正常分娩后，在小鼠出生2.5～3.0 d時對新生小鼠進行解剖，取其各組織器官，將同一胎新生鼠組織收集在一起作為一組樣本，共收集到3組新生鼠組織樣本；標記為仔鼠組的那一只孕鼠生產的小鼠哺乳18 d，將其產下的同一胎仔鼠分為3組，解剖3組仔鼠并獲得仔鼠組各組織器官蛋白樣本。每個發育階段小鼠均有3組樣本，分別對各組樣本進行檢測，蛋白表達分布結果基本一致，選擇其中具有代表性的一組予以展示。其中由于胎鼠、新生鼠、仔鼠個體器官很小，難以單獨進行蛋白測定，因此將同組小鼠的同種器官收集在一起進行蛋白檢測，成年鼠為單獨個體蛋白檢測。整個實驗過程均遵循中國科學技術委員會頒發的《實驗動物管理條例》。

1.2.2蛋白樣品制備 從活體取到組織后，將其迅速放入液氮速凍，然后將速凍的組織放入-80 ℃長期保存。待制備蛋白樣品時從-80 ℃超低溫冰箱取出需要的組織，液氮下研磨，研磨好的組織裝在1.5 mL滅菌EP管內。按照0.1 g組織加入1 mL的RIPA和10 L PMSF的比例加入RIPA和PMSF并用渦旋震蕩混勻器充分震蕩混勻，混勻后的混合液置于冰上裂解1.5 h，由于PMSF在水溶液中不穩定，因此在裂解40 min左右補加一定比例的PMSF。隨后超聲破碎DNA，4 ℃，16 000 r/min離心取上清液并按一定比例加入Loading Buffer，沸水浴 5 min，分裝樣品，蠟膜密封EP管，-20 ℃保存，使用時取出融化、混勻、低速離心即可。

1.2.3Western blot 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%。濕轉膜法，250 mA恒流將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。轉完膜后取出PVDF膜，用TBST洗膜5 min以洗去膜上的電轉液，并用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜(12～16 h)。次日回收一抗，TBST洗膜3×10 min，之后室溫孵育二抗1 h，TBST 2×5 min再TBS 1×5 min洗二抗，ECL發光，X線片暗盒曝光并用GelDocXR+ System采集圖像。圖像采集和分析均來自于Image Lab software(Bio-Rad Laboratories;Version 4.0.1)。

2 結 果

2.1Nodal及其受體在胎鼠組織器官中的表達分布 取13種胎鼠組織器官進行Western blot檢測，發現大腦、小腦、皮膚、肝、胰腺、骨骼肌和腎等多種器官中有不同程度Pro-Nodal蛋白表達，其中肝臟表達最強，大腦、小腦、胰腺、骨骼肌和腎臟表達較強，只有皮膚有少量表達，其余6種胎鼠組織器官未見Nodal蛋白表達(圖1)。在表達Nodal蛋白的幾種器官中，骨骼肌有少量Nodal受體ALK7-1和ALK4-1蛋白表達，以及較強的輔助受體Cripto-1蛋白表達。此外，在胎鼠骨骼肌中還檢測到ALK7的剪接異構體ALK7-3和ALK4的剪接異構體ALK4-2蛋白有較強表達。在胎鼠腎臟、肝臟和皮膚中檢測到ALK7-1蛋白表達。此外，這3種組織器官還不同程度地表達了ALK4和ALK7的其他剪接異構體，肝臟還表達了較強的Cripto-1蛋白。大腦、小腦、胰等組織器官雖然表達Nodal蛋白，但是未檢測到ALK7-1和ALK4-1蛋白表達，只是不同程度表達了ALK7-1和ALK4-1以外的剪接異構體蛋白，這3種器官均無Cripto-1蛋白表達。在不表達Nodal的器官中，胎鼠小腸、胸腺和心臟幾乎未能檢測到這幾種蛋白的表達，而肺、胃和膀胱有較強的ALK4-2表達，其中肺和胃還有較強Cripto-1蛋白表達。

圖1 Nodal及其受體在胎鼠組織器官中的表達分布

2.2Nodal及其受體在新生鼠組織器官中的表達分布 用Western blot方法共檢測14種新生鼠組織器官，其中大腦、小腦、肝、肺、皮膚、胰腺、脾、骨骼肌和心臟等9種器官中有不同程度的Pro-Nodal蛋白表達，與胎鼠一樣，肝臟有最強表達，并且還觀察到少量成熟Nodal蛋白表達(圖2)。在表達Nodal蛋白的9種器官中，皮膚、骨骼肌、心臟和腎臟中檢測到ALK7-1和ALK4-1蛋白表達。在肝臟中雖高表達Nodal蛋白，但未檢測到ALK7-1蛋白表達，不過有較強的ALK4-1和Cripto-1蛋白表達。大腦、小腦、肺和脾4種器官中雖然有較強的Nodal蛋白表達，但是無受體ALK7-1或 ALK4-1蛋白表達。小腸、胃、膀胱和胸腺4種器官均觀察到較強的受體ALK7-1蛋白表達，但是未檢測Nodal表達。

圖2 Nodal及其受體在新生鼠組織器官中的表達分布

2.3Nodal及其受體在仔鼠組織器官中的表達分布 在已檢測的14種仔鼠組織器官中，僅有大腦、小腦、肝、脾和腎等5種器官中有Nodal蛋白表達，可見仔鼠表達Nodal的器官明顯比新生鼠更少(圖3)。此外，在肝和腎主要觀察到的是成熟Nodal蛋白而不是前體蛋白，這也明顯與胎鼠和新生鼠不同。在表達Nodal蛋白的器官中，腎既表達ALK7-1又表達ALK4-1蛋白，并且還同時表達Cripto-1，大腦、小腦和肝只表達了ALK4-1，而脾僅同時表達ALK7-1蛋白。其余不表達Nodal蛋白的9種組織器官中，大腸、小腸、胃、膀胱、骨骼肌和心臟均有受體ALK7-1蛋白達。

圖3 Nodal及其受體在仔鼠組織器官中的表達分布

2.4Nodal及其受體在成年鼠組織器官中的表達分布 4個時期的小鼠組織器官中，成年鼠檢測的器官數量最多，并且表達模式也最豐富，特別是在檢測的所有器官中均有較強的ALK7-1蛋白表達(圖4)。在選取的20種成年鼠組織器官中，肝、大腦、小腦、脊髓、睪丸、肺、乳腺、脾、胃、大腸、腎、心和前列腺等13種器官有不同程度的Nodal蛋白表達。以表達成熟Nodal蛋白為主，特別在腎和心臟兩種器官中高表達成熟Nodal蛋白。在表達Nodal蛋白的組織器官中，肝、小腦和脊髓同時表達了ALK7-1和ALK4-1及Cripto-1蛋白。大腦、睪丸、肺、乳腺、脾、胃、大腸、腎、心和前列腺等10種表達Nodal的器官同時也表達了ALK7-1蛋白，大部分組織器官還表達了Cripto-1蛋白，均未檢測ALK4-1表達。不僅所有成年鼠組織器官表達ALK7-1，而且ALK7的其他剪接異構體也在這些器官中有較強表達。但是僅有肝、胰、小腦和脊髓等4種組織器官表達ALK4的剪接異構體，這明顯與前面3個時期的表達模式不同。

圖4 Nodal及其受體在成年鼠組織器官中的表達分布

3 討 論

現有研究已知Nodal分子在早期胚胎發育和體軸左右不對稱形成過程中發揮重要作用[3,6]，但是Nodal分子在個體發育后期中是否發揮作用并未見相關報道。本研究檢測了Nodal及其受體蛋白在小鼠個體發育后期的4個不同時期中的表達情況，以提示其可能具有的功能。結合4個發育時期的結果進行分析，發現Nodal蛋白在4個時期的大腦、小腦、肝、腎等4種組織器官中均有表達；由于受個體太小的限制，未檢測胎鼠脾臟中Nodal蛋白，不過在新生鼠、仔鼠和成年鼠3個時期的脾臟中均檢測到Nodal蛋白；此外，除胎鼠肺中未檢測到Nodal蛋白外，在新生鼠、仔鼠和成年鼠3個時期的肺中均檢測到Nodal蛋白。如果再結合Nodal受體的表達進行分析，僅僅只有肝和腎這兩種器官是既有Nodal分子表達又有受體ALK7-1和(或)ALK4-1，以及輔助受體Cripo-1蛋白表達。這些結果提示在已檢測的多種器官中，Nodal信號通路可能對小鼠肝和腎的生長發育過程有一定作用。在大腦、小腦、脾和肺等4種器官發育過程中均有Nodal蛋白表達，但未檢測到其受體ALK7-1和(或)ALK4-1蛋白表達，這有可能Nodal分子通過ALK7或ALK4的其他剪接異構體或者通過其他未知Nodal受體起作用。此外，只有胰腺和骨骼肌這兩種被檢測的器官是在較早期的胎鼠和新生鼠階段有Nodal蛋白表達，而在后期的仔鼠和成年鼠階段卻不表達。

關于Nodal及其受體在胚胎發育過程中表達與功能研究的文獻較多，但是未檢索到Nodal及其受體在個體發育后期至成年之前時基因表達和功能研究的文獻，不過已有少量文獻報道了Nodal及其受體在成年動物中表達。ZHAO等[11]發現Nodal在草魚的垂體、大腦、心、腎和脾等組織器官中有少量mRNA表達，而在生殖腺細胞中有較強表達。Nodal及其受體還在小鼠的乳腺上皮細胞、睪丸雄性生殖細胞[12-15]，以及成年人的胰島和子宮內膜中有表達[16-18]。本實驗結果發現大多數成年鼠組織器官中均有Nodal及其受體蛋白的表達。這不僅印證和進一步豐富了現有相關文獻，也提示Nodal可能并不適宜作為腫瘤免疫治療的靶點。因為最近已有文獻報道Nodal在惡性腫瘤細胞中高表達，可能與腫瘤的發生、侵襲和轉移相關[9]，甚至已開發出單克隆抗體進行治療實驗[19]。但是如果在人正常組織中存在Nodal表達，針對Nodal分子的單克隆抗體治療很可能會影響正常組織器官的功能。HOOIJKAAS等[10]報道Nodal蛋白在健康人腎臟組織中有較強表達，本研究也發現在所有檢測的成年鼠組織器官中腎臟有最強的Nodal蛋白表達。

本研究除檢測到已知作為Nodal分子受體的ALK7-1和ALK4-1蛋白表達外，還在不同發育時期和不同組織器官中不同程度地檢測到ALK7和ALK4功能未知的其他剪接異構蛋白表達。提示ALK7和ALK4的這些剪接異構蛋白應該在相應的小鼠組織器官具有一定功能，具體功能有待進一步探索。另一有趣現象是發現胎鼠和新生鼠檢測到的Nodal蛋白均為前體形式，而仔鼠和成年鼠的多種組織器官中僅檢測到成熟Nodal蛋白。成熟Nodal一般不穩定，為什么會在這些組織器官中被大量檢測到還有待進一步研究。

綜上所述，Nodal分子在小鼠個體發育后期4個階段的多種組織器官中有較強表達，特別是在成年鼠的大部分組織器官中均存在不同程度表達，提示Nodal分子可能并不適合作為腫瘤免疫治療的靶點。Nodal及其受體在小鼠個體發育4個不同階段的肝和腎臟中均有表達，提示Nodal信號可能對這兩種器官的生長發育有一定作用。此外，在大多數成年鼠組織器官中有完整的Nodal信號通路，說明Nodal信號對維持這些器官的功能活動應有相應作用。因此，有必要在后續研究中進一步探究Nodal信號在維持個體發育和成年鼠組織器官中發揮作用的分子機制。

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