has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因多態(tài)性與新疆漢族和維吾爾族乳腺癌的相關性研究*

陳 晶，趙 璐，宋 牧，木拉提·庫爾班，鄒慶濤，孫國輝

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科,烏魯木齊 830000)

乳腺癌是一種高發(fā)的多基因性疾病，遺傳基因易感性起著重要作用，發(fā)病存在一定的種族、地域及社會階層的差異性[1]。新疆維吾爾族居住地域特色鮮明，本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，其與漢族乳腺癌相比表現(xiàn)為發(fā)病年齡較早，病期晚，淋巴結轉移率高，預后較差等特點，因而認為維吾爾族乳腺癌發(fā)病可能有其特定的種族遺傳易感性[2]。微小RNA(miRNA)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，成為目前研究的熱點[3]。本研究從相關pre-miRNA位點has-miR-125a-5p、 hsa-miR-196a2 單核苷酸基因多態(tài)性入手，通過分離外周血淋巴細胞獲取標本，采用RT-PCR技術檢測維吾爾族和漢族乳腺癌患者外周血的基因多態(tài)性，并以健康人群作為對照進行分析，為開展個體化預防和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會同意(批準文號：20140131L001)，選取2014年1月至2017年1月新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院及附屬腫瘤醫(yī)院收治的女性乳腺癌患者200例為病例組(維吾爾族及漢族各100例)。納入標準：(1)初治原發(fā)性乳腺癌病例，無手術和放化療病史；(2)維吾爾族及漢族女性，卡氏評分大于或等于80分，可完成手術切除；(3)無嚴重的其他臟器功能障礙和并發(fā)癥，在新疆地區(qū)居住滿10年以上。病例組年齡25～72歲；BMI 19～28 kg/m2；在新疆地區(qū)居住時間11～53年。另取女性志愿者200例為對照組(維吾爾族及漢族各100例)，納入標準：(1)按年齡進行1∶1匹配選擇對照，年齡配比在±5歲范圍內；(2)同期參加健康體檢且結果健康的維吾爾族及漢族女性；(3)在新疆地區(qū)居住滿10年以上，并排除惡性腫瘤、生殖系統(tǒng)疾病、內分泌疾病和肝腎疾病。對照組年齡24～70歲；BMI 20～28 kg/m2；在新疆地區(qū)居住時間14～55年。所有研究對象對本次試驗知情并簽署同意書，病例組與對照組在年齡、BMI和新疆地區(qū)居住時間方面比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2方法

1.2.1實驗儀器與試劑 (1)7700全自動熒光PCR檢測儀，購自美國Applied Biosystems公司；(2)低溫高速離心機，購自德國EPPENDOR公司；(3)超純水，購自美國PROMEGA公司；(4)移液槍、吸頭和離心管，購自上海和森生物科技有限公司；(5)基因提取試劑盒、引物及探針，購自美國Applied Biosystems公司。

表1 兩組一般資料比較

1.2.2研究方法

1.2.2.1患者臨床資料收集 參閱以往同類研究，制訂人口學特征調查問卷[4]。由經(jīng)過專門訓練的調查者通過面訪的方式對病例組進行調查，內容包括：年齡、文化程度、BMI、婚姻狀況、生育史、哺乳狀況、哺乳時間和癌癥家族史。同時收集患者腫瘤病理學特征，包括：腫瘤大小、淋巴結轉移個數(shù)、美國癌癥聯(lián)合委員會(American joint committee on cancer，AJCC)分期、受體表達情況[激素受體(hormone receptor，HR)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progestrone receptor，PR)和人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，Her-2)]及分子分型。

1.2.2.2RT-PCR操作步驟 (1)樣品RNA的抽提：取所有研究對象凍存已裂解的細胞，室溫放置5 min使其完全溶解，兩相分離，RNA沉淀，RNA清洗，RNA干燥，溶解RNA沉淀。(2)RNA質量檢測。(3)樣品cDNA合成。(4)梯度稀釋的標準品及待測樣品的基因實時定量PCR。(5)制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板；選擇表達has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因的cDNA模板進行PCR反應，PCR產(chǎn)物與DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋。(6)待測樣品的待測基因實時定量PCR：所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應體系；將配置好的PCR反應溶液置于Real-time PCR儀上進行PCR擴增反應。

1.2.3觀察指標 (1)病例組中漢族與維吾爾族患者人口學特征及腫瘤病理學特征；(2)病例組和對照組不同民族患者has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因的表達水平。

2 結 果

2.1漢族與維吾爾族乳腺癌患者人口學特征比較 年齡階層方面，漢族和維吾爾族患者35～65歲的比例最高；BMI方面，漢族患者小于25 kg/m2的比例較大，維吾爾族患者大于或等于25 kg/m2的比例較大；文化程度方面，漢族患者高中的比例最高，維吾爾族患者高中以下的比例最高；婚姻狀況方面，漢族和維吾爾族患者已婚的比例較大；生育狀況方面，漢族患者1胎的比例最高，維吾爾族患者1胎以上的比例最高；漢族和維吾爾族患者有哺乳史的比例較大；哺乳時間方面，漢族和維吾爾族患者大于或等于10個月的比例較大；漢族和維吾爾族患者無癌癥家族史的比例較大，見表2。

表2 漢族與維吾爾族乳腺癌患者人口學特征比較(%)

2.2漢族與維吾爾族乳腺癌患者腫瘤病理學特征比較 腫瘤大小方面，漢族患者小于2 cm的比例最高，維吾爾族患者2～5 cm的比例最高；淋巴結轉移個數(shù)方面，漢族和維吾爾族患者0個的比例最高；AJCC分期方面，漢族和維吾爾族患者Tis～Ⅱ期的比例較高；分子分型方面，漢族和維吾爾族Luminal B型的比例最高；漢族患者HR(+)的比例高于維吾爾族患者(P<0.05)，兩組ER、PR和Her-2表達情況比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 漢族與維吾爾族乳腺癌患者腫瘤病理學特征比較(%)

2.34組has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因表達水平比較 經(jīng)RT-PCR檢測，has-mir-125a-5p在4組中表達量由高到低依次為漢族對照組、維吾爾族對照組、漢族病例組和維吾爾族病例組，has-mir-196a2在4組中表達量由高到低依次為維吾爾族病例組、漢族病例組、維吾爾族對照組和健康漢族對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 4組has-mir-125a-5p和has-mir-196a2 基因表達水平比較

a：P<0.05，與維吾爾族病例組比較；b：P<0.05，與維吾爾族對照組比較；c：P<0.05，與漢族病例組比較

3 討 論

數(shù)據(jù)表明，全世界每年新增乳腺癌患者約為130萬，其中約45萬死于該病[5]。近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率和病死率也呈逐年遞增的趨勢，并且具有年輕化、家族聚集等特征[6-7]。在新疆地區(qū)，乳腺癌是繼宮頸癌后第2位危害女性健康和家庭幸福的惡性腫瘤，因此，做好乳腺癌的防治工作具有深遠的社會意義。新疆是個多民族聚集地，以漢族和維吾爾族為主，分別占總人口的45.7%和39.8%，維吾爾族女性在乳腺癌的發(fā)病上與漢族存在明顯差異，表現(xiàn)為原發(fā)病灶體積大、淋巴結轉移多及預后差等特征。除飲食習慣、婚育情況等人口學特征外，基因也是形成維吾爾族與漢族女性乳腺癌發(fā)病差異的重要因素[8]。miR-125是在小鼠腦組織中克隆得到的與線蟲miRNA-Lin-4高度同源的miRNA，具有前體和成熟體兩種形式。成熟體可繼而分為has-mir-125a-5p和has-mir-125a-3p。在已有的研究報道中，has-mir-125a的研究主要集中在has-mir-125a-5p[9]。有學者以乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤為材料，分析得出腫瘤中miRNA編碼區(qū)表現(xiàn)出很高的突變頻率并發(fā)現(xiàn)乳腺癌中has-mir-125a-5p成熟序列中單核苷酸多態(tài)性可使miRNA表達量下調[10]。在人類基因組中，miRNA前體區(qū)域has-mir-125a-5p位于染色體19q13.41，這一區(qū)域常常在惡性腫瘤中被削減，因此可推斷其作為抑癌基因參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程[11]。研究發(fā)現(xiàn)，has-mir-196a的單核苷酸多態(tài)性與肺癌患者的預后相關，同時也提高了我國女性乳腺癌的發(fā)病風險，其機制可能與下調Hox基因家族成員和膜鏈蛋白Al的表達有關[12]。盡管以上研究提示has-mir-125a-5p和has-mir-196a的單核苷酸多態(tài)性影響了乳腺癌的發(fā)病風險，但民族間的突變比較研究尚待進一步開展。

從本次研究的結果來看，與漢族患者相比，維吾爾族患者年齡偏小，BMI較高，生育數(shù)量較多，哺乳時間較長，可能是由環(huán)境因素及相關民族政策導致，維吾爾族女性以高熱量飲食為主，多數(shù)早婚、多育，且基本上為母乳喂養(yǎng)；維吾爾族患者腫瘤較大、淋巴結轉移個數(shù)較多、AJCC分期較高，Basal-like型乳腺癌比例較高，HR陰性的比例較高，與李雙武等[13]研究的結果一致。說明與漢族女性相比，新疆地區(qū)維吾爾族乳腺癌患者預后較為不良，可能與上述人口學特征方面的差異有關。在李鵬飛等[14]的研究中，乳腺癌患者血漿has-mir-125a-5p水平低于健康人群，has-mir-196a2水平高于健康人群，本次研究中has-mir-125a-5p和has-mir-196a2在4組中表達量與該結果相吻合，同時與has-mir-125a-5p的抑癌作用及has-mir-196a2的致癌作用一致。因此，本研究推測上述兩基因某些位點的突變造成乳腺癌遺傳易感性的變化是導致維吾爾族與漢族乳腺癌預后差異的重要因素。值得一提的是，維吾爾族對照組與

漢族病例組間兩基因表達量的差異，在接下來的研究中本課題組應以has-mir-125a-5p與has-mir-196a2基因的單核苷酸多態(tài)性為切入點，進行不同基因型與預后的相關性研究。

綜上所述，與新疆地區(qū)漢族女性相比，維吾爾族乳腺癌患者總體預后較差，其機制可能與has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因的表達有關，對相關miRNAs基因的檢測可為篩查及預防提供理論依據(jù)。

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