ZBTB20在SLE患者外周血B細(xì)胞中的表達(dá)和臨床意義*

裴 露，王婷婷，朱 峰，胡文壇，劉紅春△

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450002；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450003)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種因B細(xì)胞異常活化，T細(xì)胞激活機(jī)制異常，機(jī)體對(duì)免疫復(fù)合物清除障礙并累及全身多器官多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病[1-2]。目前SLE的發(fā)病機(jī)制尚不明確,一般認(rèn)為其機(jī)制是由遺傳、自身免疫等諸多因素共同作用，使機(jī)體免疫系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂而引起機(jī)體發(fā)病。有研究表明SLE中由B細(xì)胞異常分化的漿細(xì)胞對(duì)自身抗原具有特異性和高親和力，并且可以產(chǎn)生大量的抗體而導(dǎo)致SLE的發(fā)病[3-4]。鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域蛋白20(ZBTB20),也稱(chēng)為HOF、DPZF和Zfp288，與Bcl6同源，是一種廣泛的鋅指復(fù)合體[5]。同時(shí)ZBTB20也參與細(xì)胞功能，包括細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、增殖及腫瘤的發(fā)生[6-7]。近年有研究表明，ZBTB20是淋巴細(xì)胞分化重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控免疫細(xì)胞相關(guān)增殖、分化通路參與到免疫反應(yīng)中，可誘導(dǎo)異常的體液免疫反應(yīng)，尤其是B細(xì)胞過(guò)度活化引起的自身免疫性疾病的發(fā)病。ZBTB20依賴(lài)干擾素調(diào)節(jié)因子-4(IRF4)啟動(dòng)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，促進(jìn)其生發(fā)中心反應(yīng)，維持漿細(xì)胞的壽命并且分泌免疫球蛋白[8]。因此，ZBTB20在SLE的發(fā)病機(jī)制中起了至關(guān)重要的作用，與B細(xì)胞過(guò)度活化分化為漿細(xì)胞并且持續(xù)分泌自身抗體相關(guān)。該研究主要通過(guò)檢測(cè)ZBTB20在SLE外周血CD19+B細(xì)胞中的表達(dá)及與漿細(xì)胞的相關(guān)性，初步探討ZBTB20與SLE發(fā)病的相關(guān)性及可能參與的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對(duì)象 從鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2016年8月至2017年2月的住院患者中選取36例初次確診SLE的患者為SLE組，其中男2例，女34例，年齡19～48歲，平均(31±7)歲。患者均符合2009年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)制訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除患有感染，腫瘤及其他自身免疫性疾病的患者。對(duì)照組為30例健康體檢者，其中男4例，女26例，年齡24～50歲，平均(35±6)歲。兩組在性別及年齡方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有對(duì)象簽署知情同意書(shū)，研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑與材料 人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)；磁珠分選柱、CD19磁珠(德國(guó)美天旎公司)；FITC標(biāo)記的抗人CD138抗體(美國(guó)BD公司，批號(hào)：347193，1∶100稀釋)；PerCPCY5.5標(biāo)記的鼠抗人CD19抗體(美國(guó)eBioscience公司)；TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，ZBTB20引物上游序列：5′-CCGCAGACAAACCAGCTAGA-3′，下游序列：5′-AAGGCTGTTGTAGGACGCTC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物上游序列：5′-AGAAGGCTGGGCTCATTTG-3′，下游序列：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2方法

1.2.1分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs) 清晨空腹抽取SLE組及對(duì)照組肘靜脈血10 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，保存于4 ℃，采集后2 h內(nèi)處理標(biāo)本，用Ficoll梯度密度離心法分離PBMCs，分別用于磁珠分選提取CD19+B 細(xì)胞和流式細(xì)胞檢測(cè)B細(xì)胞亞群。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)ZBTB20的表達(dá) TRIZOL法提取磁珠分選的CD19+B細(xì)胞總RNA，Oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,之后凍存于-80 ℃冰箱以備用。管家基因GAPDH為內(nèi)參，之后放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；變性95 ℃ 10 s，60 ℃退火延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃繪制溶解曲線。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Western blot分析外周血ZBTB20蛋白水平 用紅細(xì)胞裂解液提取PMBCs,然后提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)外周血ZBTB20蛋白的表達(dá)。

1.2.4熒光標(biāo)記人外周血PBMC及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 用400 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸PBMCs，設(shè)置空白對(duì)照、CD19-PerCPCY5.5 2 μL單標(biāo)、CD138-FITC 4 μL和CD138-FITC 4 μL+CD19-PerCPCY5.5 2 μL雙標(biāo)樣本管，輕輕混勻后，置4 ℃避光孵育30 min；各管加入2 mL PBS后混勻；1 000 r/min，4 ℃,離心5 min，棄上清液；重復(fù)加入PBS 2 mL混勻，再以1 000 r/min，4 ℃,離心5 min；各個(gè)管中加固定液200 μL，混勻后，4 ℃避光1～2 h后上機(jī)檢測(cè)。使用美國(guó)BD公司的FACS calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各管CD19-CD138+漿細(xì)胞/CD19+B細(xì)胞比例，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1外周血CD19+B細(xì)胞ZBTB20 mRNA和外周血ZBTB20蛋白表達(dá) SLE組ZBTB20 mRNA的表達(dá)水平(0.527±0.181)明顯高于對(duì)照組(0.246±0.145)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。SLE組ZBTB20 蛋白的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

2.2SLE組B細(xì)胞亞群的比例 與對(duì)照組比，SLE組CD19+B細(xì)胞比例降低，CD19-CD138+漿細(xì)胞比例及CD19-CD138+漿細(xì)胞/CD19+B細(xì)胞比值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1、圖2。

2.3CD19+B細(xì)胞中ZBTB20 mRNA表達(dá)水平與B細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析 SLE患者中ZBTB20 mRNA表達(dá)水平與CD19-CD138+漿細(xì)胞比例呈明顯正相關(guān)(r=0.165，P=0.028)，與CD19-CD138+漿細(xì)胞/CD19+B細(xì)胞的比值也呈正相關(guān)(r=0.225，P=0.021)；與對(duì)照組無(wú)相關(guān)性(r=-1.45，P=0.32)，見(jiàn)圖3。

A:兩組外周血CD19+B細(xì)胞中ZBTB20 mRNA表達(dá)，B：兩組ZBTB20蛋白水平

圖1 兩組ZBTB20表達(dá)水平表1 SLE組B淋巴細(xì)胞亞群之間的比較[M(P25,P75)]

圖2 SLE組和對(duì)照組外周血B細(xì)胞比例(A)、漿細(xì)胞比例(B)、漿細(xì)胞/B細(xì)胞(C)比值

圖3 ZBTB20 mRNA與CD19-CD138+漿細(xì)胞/ CD19+B細(xì)胞比值的相關(guān)性分析

2.4SLE組ZBTB20mRNA表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 SLE組ZBTB20 mRNA的表達(dá)與SLE活動(dòng)期指標(biāo)均呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3 討 論

ZBTB20最早是在人樹(shù)突狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的鋅指蛋白家族的新成員，因具有BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和5個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域得名[9]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)ZBTB20可通過(guò)調(diào)控免疫細(xì)胞從而參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，參與調(diào)控的關(guān)鍵就是可以促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，維持一部分漿細(xì)胞的壽命并分泌抗體，在這個(gè)調(diào)控過(guò)程中可能是由于存在IRF4-ZBTB20-Blimp1調(diào)節(jié)通路從而發(fā)揮了重要的作用[10]。韓國(guó)研究者LEE等[11]對(duì)1 596例SLE患者和2 640例健康者進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)性研究，從中篩選出16個(gè)SLE新易感基因，ZBTB20就是其中之一。ELMANN等[12]通過(guò)對(duì)SLE模型鼠脾細(xì)胞提取總的RNA進(jìn)行檢測(cè)，患病小鼠ZBTB20 mRNA的表達(dá)與未患病小鼠相比上調(diào) 1.9倍，RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了微陣列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。ELMANN認(rèn)為，ZBTB20 mRNA表達(dá)明顯增加，可能與促進(jìn)腎組織形成免疫復(fù)合物沉淀有關(guān)。上述研究結(jié)果提示ZBTB20在SLE發(fā)病機(jī)制中可能起到了關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，SLE組患者外周血B細(xì)胞中ZBTB20 mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,提示ZBTB20可能參與SLE發(fā)病。

ZBTB20在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，參與機(jī)體獲得性免疫和固有免疫[13]。ZBTB20通過(guò)正向調(diào)控Toll樣受體(TLR)，介導(dǎo)核因子kappa B(NF-κB)激活，參與固有免疫反應(yīng)[14-15]。ZBTB20在生發(fā)中心成熟的B細(xì)胞中表達(dá)，隨B細(xì)胞分化成熟ZBTB20的表達(dá)也逐漸增加，然后依賴(lài)干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF-4)促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞,同時(shí)也與B細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子B淋巴細(xì)胞成熟蛋白1(Blimp-1)存在著某種調(diào)節(jié)作用。本研究顯示，SLE患者外周血CD19+B細(xì)胞比例明顯降低，表明B細(xì)胞過(guò)度激活分化為漿細(xì)胞是SLE發(fā)病最主要的免疫學(xué)特征之一。并且SLE患者ZBTB20 mRNA的表達(dá)與CD19-CD138+漿細(xì)胞比例、CD19-CD138+漿細(xì)胞/CD19+B細(xì)胞比值均呈正相關(guān)，說(shuō)明ZBTB20可能通過(guò)參與B細(xì)胞異常分化而參與SLE發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，ZBTB20在SLE患者體內(nèi)的表達(dá)水平增加，這與B細(xì)胞異常分化為漿細(xì)胞且分泌的自身抗體有關(guān)，提示ZBTB20可能通過(guò)調(diào)節(jié)B細(xì)胞異常分化參與到SLE發(fā)病機(jī)制中，這也為以后研究提供了新思路。

參考文獻(xiàn)

[1]RAHMAN A,ISENBERG D A.Systemic lupus erythematosus[J].N Engl J Med,2008,358(9):929-939.

[2]RAPOPORT M,BLOCH O.Systemic lupus erythematosus[J].N Engl J Med,2012,366(6):574.

[3]TSOKOS G C.Systemic lupus erythematosus[J].N Engl J Med,2011,365(22):2110-2121.

[4]CHONG B F,MOHAN C.Targeting the CXCR4/CXCL12 axis in systemic lupus erythematosus[J].Expert Opin Ther Targets,2009,13(10):1147-1153.

[5]ALBAGLI O.The BTB/POZ domain:a new protein-protein interaction motif common to DNA- and actin-binding proteins[J].Cell Growth Differ,1995,6(9):1193-1198.

[6]LEE S U,MAEDA T.POK/ZBTB proteins:an emerging family of proteins that regulate lymphoid development and function[J].Immunol Rev,2012,247(1):107-119.

[7]KAN H.Zinc finger protein ZBTB20 is an independent prognostic marker and promotes tumor growth of human hepatocellular carcinoma by repressing FoxO1[J].Oncotarget,2016,7(12):14336-14349.

[8]CHEVRIER S.The BTB-ZF transcription factor Zbtb20 is driven by Irf4 to promote plasma cell differentiation and longevity[J].J Exp Med,2014,211(5):827-840.

[9]STOGIOS P J.Sequence and structural analysis of BTB domain proteins[J].Genome Biol,2005,6(10):R82.

[10]WANG Y.Adjuvant-specific regulation of long-term antibody responses by ZBTB20[J].J Exp Med,2014,211(5):841-856.

[11]LEE H S.Ethnic specificity of lupus-associated loci identified in a genome-wide association study in Korean women[J].Ann Rheum Dis,2014,73(6):1240-1245.

[12]ELMANN A.Altered gene expression in mice with lupus treated with edratide,a peptide that ameliorates the disease manifestations[J].Arthritis Rheum,2007,56(7):2371-2381.

[13]ZHANG W.Identification and characterization of DPZF,a novel human BTB/POZ zinc finger protein sharing homology to BCL-6[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,282(4):1067-1073.

[14]WANG Q.Zinc finger protein ZBTB20 expression is increased in hepatocellular carcinoma and associated with poor prognosis[J].BMC Cancer,2011(11):271.

[15]GU S,RAN S,QIN F,et al.Human dental pulp stem cells via the NF-kappaB pathway[J].Cell Physiol Biochem,2015,36(5):1725-1734.