結直腸癌HER2及Ki-67表達的關系及預后因素分析*

孫旭凌，申 婧，黃桂林，李豫江，李志剛△

(石河子大學醫學院第一附屬醫院：1.普外二科;2.神經內科，新疆石河子 832008)

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。從2000年到2011年，我國結直腸癌發病率及年齡標準化發病率顯著上升[1]。人表皮生長因子受體 2(HER2)是人類原癌基因之一，對結直腸癌細胞生長和生存有著重要的調節作用。細胞增殖核抗原(Ki-67)是具有代表性的增殖抗原之一，與腫瘤的增殖、轉移相關。本研究通過比較結直腸癌患者中HER2和Ki-67的表達情況，觀察其與臨床病理特征的關系，探討二者的相關性及對預后的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1-12月本院結直腸癌患者石蠟病理標本71例。所有患者術前均未經過化療，其中有5例術前肝轉移，1例肺轉移。患者中男33例，女38例；年齡34～79歲，中位年齡62歲；右半結腸癌11例，橫結腸2例，左半結腸癌18例，直腸癌39例，多發癌(降結腸+低位直腸癌)1例；高分化5例，中分化56例，低分化10例；T1期3例，T2期23例，T3期22例，T4期23例；無淋巴結轉移47例，淋巴結轉移24例(12例N1，12例N2)；Ⅰ期19例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例。同時選擇30例距腫瘤大于5 cm的癌旁正常組織作為對照。

1.2方法

1.2.1試劑與方法 兔抗人HER2單克隆抗體和鼠抗人Ki-67單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。采用免疫組織化學SP法，標本切片，脫蠟、水化，經0.3%H2O2消化內源性過氧化物酶后，再高壓抗原修復，一抗、二抗、三抗作用后，用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.2結果判定 由兩名高級職稱醫師進行讀片。Ki-67以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性，HER2陽性表達以細胞膜出現棕黃色顆粒為準。(1)HER2參照美國臨床腫瘤協會提出的HER2檢測指南[2]。(-)：腫瘤細胞沒有染色或少于10%細胞膜染色；(+)： >10%細胞有不完整的胞膜染色；(2+)：>10%細胞有完整的但較弱的胞膜染色；(3+)：>30%細胞有完整的較強的胞膜染色。(2)Ki-67按陽性細胞所占比例數分類如下。(-)： ≤10%， (+)：11%～24%，(2+)：>24%～50%，(3+)：>50%。上述結果(-)歸為陰性表達組，(+)、(2+)、(3+)歸為陽性表達組。本研究71例結直腸癌組織中Ki-67陽性表達率高，從5%到95%，不服從正態分布，中位數75%，以此將Ki-67分為高表達、低表達組。

1.2.3隨訪 術后采用電話及入戶方式進行隨訪，起點為手術日，終點為患者出現死亡、失訪或至截止時間(2015年12月30日)，隨訪結束時，獲得完整隨訪資料69例，隨訪率為97.1%。18例患者死亡，其中15例死于癌轉移，2例死于心梗，1例死于肝硬化。術前肝轉移的4例患者中3例死亡，1例帶瘤生存。術后出現轉移的患者有9例，其中5例肝轉移，3例肺轉移，1例骨轉移。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行統計學處理，計數資料的比較用χ2檢驗，相關性采用Spearman相關性分析，生存分析采用Kaplan-Meier和Longrank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險模型，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HER2、Ki-67在結直腸癌組織和癌旁組織的表達 HER2結直腸癌組織陽性表達率為32.4%(23/71)，高于癌旁組織的10.0%(3/30)，差異有統計學意義(χ2=5.533，P=0.019)。Ki-67在結直腸癌組織陽性表達率為85.9%(61/71)，高于癌旁組織的6.7% (2/30)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=56.437，P=0.001)，見圖1、2。

圖1 HER2在結直腸癌組織的陽性表達(×400)

2.2HER2、Ki-67的表達與結直腸癌臨床病理特征的關系及兩者相關性 71例結直腸癌組織中，HER2陽性表達與分化程度、有無淋巴結轉移、淋巴結轉移數目、TNM分期有關(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度無關(P>0.05)。Ki-67表達與腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移、淋巴結轉移數目、TNM分期有關(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度無關(P>0.05)，見表1。HER2、Ki-67在結直腸癌組織中表達呈正相關(r=0.515，P=0.001)。

圖2 Ki-67在結直腸癌組織的陽性表達(×400)

2.3HER2、Ki-67的表達水平與結直腸癌患者術后5年無病生存率、5年生存率的關系 HER2陽性患者和陰性患者術后5年無病生存率分別為48.4%、80.8%，差異有統計學意義(χ2=7.932，P<0.05)；Ki-67高表達患者和低表達患者術后5年無病生存率分別為56.5%、85.5%，差異有統計學意義(χ2=5.747，P<0.05)。

HER2陽性患者和陰性患者術后5年生存率分別為60.9%、80.8%，差異有統計學意義(χ2=4.762，P<0.05)；Ki-67高表達患者和低表達患者術后5年生存率分別為63.9%、85.5%，差異有統計學意義(χ2=4.020，P<0.05)。

單因素分析顯示，腫瘤分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移、轉移淋巴結數目、TNM分期、HER2和 Ki-67表達情況與患者的預后均有關(P<0.05)，見表2、圖3～6。

表1 HER2、 Ki-67的表達與結直腸癌臨床病理特征的關系(n)

圖4 HER2陽性患者5年生存曲線

圖5 Ki-67陽性患者5年無病生存曲線表2 結直腸癌患者預后影響因素的單因素分析結果

臨床病理特征n生存率(%)χ2P性別0.1650.684 男3372.1 女3876.3年齡(歲)1.9310.165 <603065.6

2.4Cox模型分析影響結直腸癌患者預后的因素 Cox 多因素分析結果顯示，TNM分期、浸潤深度為影響患者預后的獨立因素，見表3。

表3 結直腸癌患者預后影響因素的Cox多因素回歸分析結果

圖6 Ki-67陽性患者5年生存曲線

3 討 論

HER2是癌基因erbB2的編碼產物，相對分子質量約為185 KU，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，屬于表皮生長因子受體家族的成員，HER2在腸癌中的臨床意義尚存在爭議。本研究結果顯示，HER2結直腸癌組織陽性表達率為32.4%(23/71)，高于癌旁組織的10.0%(3/30)，差異有統計學意義。本研究的陽性率低于張凱等[3]研究報道的62.5%(35/56)，而高于呂洋等[4]、KOUNTOURAKIS等[5]研究報道的陽性率(不到5%)。之所以報道的比例有差異，可能原因如下：(1)有的學者把HER2膜表達蛋白標準加上了細胞質陽性表達后導致比例過高；(2)由于樣本量的不同及結果判定標準和方法的差異所造成的。本研究顯示HER2陽性表達與分化程度、有無淋巴結轉移、淋巴結轉移數目、TNM有關，HER2陽性組5年無病生存率、5年生存率均低于陰性組，與王瓊等[6]研究結果相似，該研究報道HER2陽性淋巴結轉移者的表達率明顯高于無淋巴結轉移者。鄧巍等[7]研究發現結直腸癌HER2過表達與腫瘤細胞的分化程度及病理分期密切相關，HER2過表達患者的10年生存率明顯降低。分析本課題結果，HER2過表達的結直腸癌侵襲力增強、生存率降低的原因，可能與HER2能通過啟動多種轉移相關機制而增加轉移能力有關，包括細胞遷移率、體外侵襲力、Ⅳ型膠原酶活性，影響黏附分子如上皮細胞鈣黏蛋白合成等,進而刺激癌細胞增長，侵襲性增加，復發和轉移相對較快[8-9]。

Ki-67是具有代表性、應用廣泛的增殖抗原之一，在細胞周期各期中，其表達受到高度準確的調控，與腫瘤的增殖、轉移呈正相關[10]。OKIMURA等[11]研究發現Ki-67與細胞黏附分子CD44s、CD44v6等在胰腺乳突黏液腺癌及相關浸潤性癌中的表達具有相關性。本課題結果顯示Ki-67在結直腸癌組織陽性表達率為85.9%(61/71)，高于癌旁組織的6.7%(2/30)，71例結直腸癌組織中Ki-67陽性表達率極高，從5.0%到95.0%，且不服從正態分布，中位數75.0%，以此將Ki-67分為高表達、低表達組，其表達與腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移、淋巴結轉移數目、TNM分期有關.這與劉萍等[12]、馬海龍等[13]研究結果類似，證實淋巴結轉移數量越多、浸潤程度越深，Ki-67的陽性率越高。張曉雨等[14]研究顯示Ki-67陽性表達率為90.9%，Ki-67平均值為(37.47±25.14)%，以此為界，分為高表達組和低表達組，高表達組生存率低于低表達組，支持此觀點的還有史漢蒙等[15]學者，此結果和本研究一致。在本研究中，Ki-67高表達組和低表達組術后5年生存率分別為63.9%、85.5%，差異有統計學意義。本研究證實HER2與Ki-67呈正相關，共同促進腫瘤生長，究其原因，與兩者的作用機制密不可分，當HER2蛋白過表達時，HER2異源二聚體形成數目增加，導致細胞內酪氨酸激酶蛋白活化，發生酪氨酸自身磷酸化，激活多種信號傳導途徑，如磷脂酶C(PLC)、Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，引發瀑布式連鎖反應，信號傳導經細胞膜、細胞間質至細胞核，進而激活基因、促進Ki-67的活化，導致細胞的增殖，調控細胞周期引起腫瘤的迅速生長。目前HER2和Ki-67在乳腺癌有重要作用，Ki-67的14.0%值是乳腺癌基因分型的重要臨界值[16]，針對HER2的生物靶向治療已成為個體化治療的首選方案。而現在對于HER2在結直腸癌中的重要性也逐步得到專家認為，有報道顯示結直腸癌HER2也與抗EGFR治療的耐藥相關，約5%的K-ras野生型晚期結直腸癌患者中HER2高表達，這些患者均對西妥昔單抗原發耐藥，給這些患者拉帕替尼聯合曲妥珠單抗的雙重HER2抑制治療，有效率達34.7%[17]。這也為今后的結直腸癌的臨床工作提供新的思路，可以把HER2和Ki-67作用評估及治療結直腸癌的重要靶點。

本課題在進行Cox多因素分析分析時發現，HER2和Ki-67并不是結直腸癌的獨立危險因素，原因可能是兩者的陽性判定標準目前尚無統一，這還需進一步研究及驗證。

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