HPA及NRF2與喉鱗狀細胞癌發生和發展的相關性研究

邱新峰，程萬民

(天津市第五中心醫院耳鼻喉科 300450)

喉鱗狀細胞癌是較為常見的口腔上皮惡性腫瘤，臨床預后較差。流行病學研究顯示，喉鱗狀細胞癌的發病率為0.5%～1.7%，在部分地區的發病率更高，可上升3～4倍[1]。近年來基礎領域的研究顯示，生物學因子的改變可影響喉鱗狀細胞的增殖、癌細胞的侵襲或轉移等病理過程，促進早期上皮性惡性腫瘤的進展[2-3]。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)能夠分解細胞外基質，為癌細胞的轉移提供條件，而核因子E2相關因子2(NF-E2 associated factor ，NRF2)能夠影響到氧化應激損傷或者氧自由基的傳遞，促進早期鱗狀細胞的病變[4]。為了進一步揭示HPA及NRF2與喉鱗狀細胞癌發生、發展的相關性，本研究收集2015年2月至2017年2月本院保存的喉鱗狀細胞癌標本81份，觀察二者的異常表達，研究其與患者臨床病理特征間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年2月至2017年2月本院保存的喉鱗狀細胞癌標本81份(病例組)，標本來源患者中男52例，女29例,平均年齡(51.42±8.92)歲。納入標準：(1)患者臨床病理資料保存完整；(2)經病理確診為喉鱗狀細胞癌；(3)術前未接受過放化療等治療；(4)患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：(1)臨床病理資料不完整；(2)合并其他原發性腫瘤。同時選取聲帶息肉病理標本77份(對照組)，標本來源患者中男42例，女35例，平均年齡(50.89±9.10)歲。兩組受試者年齡、性別比較差異無統學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法 采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3 mm，3%H2O2室溫孵育5 min，采用去離子水沖洗3次，每次3 min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 mL純水)封閉，室溫孵育5 min，加入HPA抗體(鼠來源，購自南京碧云天生物科技有限公司)，37 ℃孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測公司)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，然后加入硝基四氮唑藍/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(NBT/BCIP)色劑顯色5 min，復染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.2.2Western blot檢測 冰上分離出組織，置于預冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。冰上靜置60 min，室溫下20 000 r/min離心60 min，取出下層沉淀。按總蛋白80 g計算上樣容積，按照比例為3∶1或者4∶1的比例上TBS緩沖液，加入20 μL緩沖液后于45 V電壓下進行電泳操作，脫脂蛋白封閉2 h，加入NRF2抗體(鼠來源，購自南京碧云天生物科技有限公司)各10 μL后室溫下孵育2 h，2 h后加入二抗(兔來源，購自南京凱基生物科技有限公司)。采用日本Panasoic公司生存的HSO-900系統影像分析儀器進行圖像分析。

1.2.3免疫組織化學結果判斷 HPA陽性表達主要定位于細胞質和細胞膜，呈棕黃色染色。每張切片選取5個高倍鏡視野，將陽性細胞比例及染色強度分為4個等級，分別對應0、1、2、3分。其中陽性細胞比例小于25%為0分，≥25%～<50%為1分，≥50%～<75%為2分，≥75%為3分；無染色為0分，淺黃色為1分，橘黃色為2分，棕黃色為3分。將陽性細胞比例及染色強度得分相加后除2得出最終分數，其中得分小于1.5分為陰性，≥1.5分為陽性。

2 結 果

2.1兩組HPA及NRF2表達比較 病例組和對照組的HPA陽性表達率和NRF表達量分別為81.48%、19.48%和0.844±0.113、0.202±0.094，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2。

圖1 Western blot檢測圖

A:病例組(SP,×400)；B：對照組(SP,×200)

圖2兩組HPA陽性表達免疫組織化學圖

2.2患者HPA陽性表達與病理特征的關系 不同年齡、性別和病灶部位患者HPA陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)；有無淋巴結轉移，不同的病理分化、TNM分期患者HPA陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 患者HPA陽性表達與病理特征的關系

續表1 患者HPA陽性表達與病理特征的關系

2.3患者NRF2表達與病理特征的關系 不同年齡、性別和病灶部位患者NRF2表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；有無淋巴結轉移，不同的病理分化、TNM分期患者NRF2水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 患者NRF2水平與病理特征的關系

3 討 論

喉鱗狀細胞癌的發生主要考慮與遺傳、吸煙或者放射性因素等有關，特別是在吸煙人群中，喉鱗狀細胞癌的發病率高于55%[5]。喉鱗狀細胞癌的臨床預后較差，5年生存率小于36%，中位生存時間不足36個月[6-7]。一項樣本量為334例，且臨床分期為中晚期的喉鱗狀細胞癌治療隨訪研究顯示，疾病的治療總體有效率小于30%，治療后的復發率及遠處轉移率較高[8-9]，病死率持續性維持在較高的水平[10]。對喉鱗狀細胞癌發生、發展過程中相關生物學機制進行研究，不僅可以為喉鱗狀細胞癌的生物學靶向治療提供參考，還可以為喉鱗狀細胞癌的臨床預后隨訪提供可靠的實驗室指標。

HPA的結構上包含了3～4個糖蛋白配體結構，能夠在結合細胞外基質的同時促進其分解，通過分解細胞外膠原纖維Ⅳ或者膠原纖維Ⅴ等，降低細胞間的緊密連接程度，為癌細胞的早期增殖或者轉移提供空間；NRF2能夠在細胞水平影響到氧化應激代謝，促使氧自由基傳遞異常導致的細胞氧化損傷，以及喉鱗狀上皮早期增殖調控異常，影響到癌細胞的持續性病變的發生[11-12]。已有的研究探討了NRF2及HPA等在喉癌患者中的異常表達，但缺乏對于其與患者臨床病理特征間的關系研究，此為本次研究的創新點。

本次研究發現，喉癌組患者的病灶組織中HPA及NRF2表達水平均明顯高于正常對照組織，提示HPA及NRF2二者可能參與到了喉鱗狀細胞癌的早期發生過程，HPA及NRF2的高表達可以從下列兩個方面影響到喉癌的進展：(1)HPA的高表達能夠提高癌細胞的早期變形及突破基底膜的能力，促使其早期臨床分期的進展；(2)NRF2的高表達能夠使三磷酸腺苷(ATP)能量代謝利用障礙，促進線粒體氧化應激異常，導致喉鱗狀細胞的細胞增殖調控紊亂。有研究者在探討喉癌患者的發病機制的過程中發現，HPA及NRF2在喉癌患者血清及病灶組織中均存在一定程度的異常表達，且相關表達水平越高，患者病情越重、臨床遠期預后越差[13-14]。在探討不同的臨床特征與生物學因子的關系過程中發現，有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者HPA陽性表達率更高，提示HPA可顯著影響到淋巴結的轉移等病理過程。從機制上考慮HPA對于相關臨床病理特征的影響主要為：(1)HPA促進了癌細胞對于淋巴結內皮細胞的黏附能力，提高了其通過淋巴結轉移的風險；(2)HPA能夠影響到癌組織對于臨床正常口腔組織或者器官的浸潤，促進臨床分期的進展。同時本研究發現HPA可以顯著影響到癌細胞的分化程度，加劇癌細胞分化不良或者低分化的風險。在探討NRF2與喉癌患者臨床特征的關系過程中，本研究也發現NRF2與患者的淋巴結轉移、臨床分期等特征具有明顯的關系，這些均提示了NRF2等與喉癌病情有密切聯系。HPA及NRF2可能在下列兩個方面發揮了一定的協同作用，從而促進了喉癌特別是鱗狀細胞癌的發生：(1)HPA及NRF2的高表達均可能影響乙酰基團的修飾及羧基末端的空間結構，干預喉癌上皮細胞的增殖、分化；(2)HPA及NRF2的協同表達可能影響核轉錄因子的轉錄活性，增加癌細胞DNA異常增殖的風險。但更為具體的內在機制的探討，仍然需要后續基礎研究證實。

綜上所述，喉鱗狀細胞癌患者HPA及NRF2表達明顯升高，與淋巴結轉移、TNM分期及病理分級有關，值得進一步研究。但本研究對于相關生物學因子的多元線性回歸的研究不足，存在一定的局限。

參考文獻

[1]HAH J H,SIM S,AN S,et al.Evaluation of the prevalence of and factors associated with laryngeal diseases among the general population[J].Laryngoscope,2015,125(11):2536-2542.

[2]ESKIIZMIR G,TANYERI TOKER G,CELIK O,et al.Predictive and prognostic factors for patients with locoregionally advanced laryngeal carcinoma treated with surgical multimodality protocol[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2017,274(3):1701-1711.

[3]HERNANDEZ-MORATO I,SHARMA S,PITMAN M J.Changes in neurotrophic factors of adult rat laryngeal muscles during nerve regeneration[J].Neuroscience,2016,333(6):44-53.

[4]卜川，魏日富，朱忠壽，等.乙酰肝素酶及NF-E2相關因子對吸煙相關喉鱗狀細胞癌的影響[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2016,30(15):1191-1194.

[5]朱奕，王勝資.吸煙相關性喉癌發生機制的研究進展[J].中國眼耳鼻喉科雜志,2015,15(3):213-215.

[6]樂飛，羅文政，唐億華，等.喉癌患者不同手術方式臨床療效及預后影響因素的探究[J].中國當代醫藥,2014,21(15):31-33.

[7]李銘儀，林輝，劉錦全，等.局部晚期聲門上喉癌的治療與預后分析[J/CD].中華臨床醫師雜志(電子版),2014,8(18):3391-3393.

[8]劉珂，錢立庭，高勁.手術聯合放療治療喉癌的療效及預后因素分析[J].臨床腫瘤學雜志,2013,18(10):910-913.

[9]李翔宇,王吉選,孫海燕,等.T3、T4期聲門型喉癌患者出現頸部淋巴結轉移的相關因素分析[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2015,29(17):1517-1518.

[10]王馳，寧博.兩種不同手術方式對喉癌患者治療預后的影響比較[J/CD].全科口腔醫學電子雜志,2015,2(8):127-128.

[11]時勝武，侯學東，周彬.乙酰肝素酶在喉鱗狀細胞癌組織中的表達和細胞定位與預后的關系[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2016,30(19):1552-1556.

[12]謝芳，董頻.喉癌預后相關因素的研究進展[J].中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志,2014,22(4):317-320.

[13]LI-QIAO Y,JIAN-WEI Z,JING-JIE L,et al.The risk factors of intraoperative anesthesia adverse events in children with laryngeal diseases[J].J Clin Anesth,2016,34(6):535-539.

[14]REIS J G C,REIS C S M,COSTA D C S D,et al.Factors associated with clinical and topographical features of laryngeal tuberculosis[J].PLoS One,2016,11(4):e0153450.