肝臟前體細胞移植對CCl4誘導的肝纖維化自發逆轉大鼠肝組織學的影響*

陳 輝，任萬雷，楊愛婷

肝臟前體細胞（hepatic progenitor cells，HPCs），或稱肝內干細胞（在嚙齒類動物，稱卵圓細胞），是肝臟損傷時一類重要的修復細胞[1-4]。HPCs有別于成熟的肝細胞，位于肝內膽管系統的終末支Hering管，具有多分化潛能、增殖能力強、免疫原性低等特點[5-11]。本研究在CCl4誘導的自發逆轉肝纖維化小鼠，將HPCs經脾靜脈移植，觀察了肝組織學的變化。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞與試劑 SPF/VAF級雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量180～200 g，分籠飼養于SPF級動物房內，溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%。用桿狀飼料喂養，去離子水裝入水瓶，供動物自由飲用。實驗在首都醫科大學附屬北京友誼醫院動物室進行。大鼠肝臟前體細胞系WB-F344由軍事醫學科學院裴雪濤教授惠贈。DMEM高糖培養基粉末、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均購自美國Gibco公司。兔抗大鼠OV6抗體購自美國RD公司，兔抗大鼠α-SMA購自美國Abcam公司，小鼠抗大鼠TIMP-1購自美國Sigma公司。檢測大鼠血清Ⅰ型膠原的ELISA試劑盒購自北京藍鯨公司。檢測大鼠白蛋白的ELISA試劑盒購自美國Abcam公司。

1.2 肝纖維化大鼠模型的制備 將24只大鼠適應喂養1 w，將其隨機分為4組，每組6只，分別為0 w（對照組）和模型組（4 w、8 w、12 w）。將 20%CCl4溶于橄欖油，給予0.2 ml.100 g-1體質量腹腔注射，2次/w，連續12 w，分別于0 w、4 w和12 w末處死大鼠，取肝組織，每塊約1×1×0.5 cm，置于10%中性甲醛中固定。

1.3 前體細胞脾內移植 取WB-F344細胞，經復蘇，接種于含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養基中，37℃、5%CO2孵箱中培養。待細胞貼壁生長，用0.25%胰酶消化、傳代。取14只大鼠，給予CCl4腹腔注射，劑量、方法同1.2，連續4 w。在造模成功后，將模型大鼠隨機分為自發逆轉組（n=7）和 HPCs移植組（n=7）。在HPCs移植組，經脾注射HPCs懸液0.5 ml（5×106個HPCs），在自發逆轉組，給予等體積PBS脾內注射。術前，給予大鼠苯巴比妥鈉（0.1 ml·100g-1）腹腔注射，行全身麻醉，皮膚消毒，沿腹正中線逐層切開腹部皮膚和肌肉，長約2 cm，打開腹腔。用棉簽托出脾臟，吸取細胞懸液，用30G針頭沿縱軸刺入脾臟，一邊緩慢回抽，一邊注射PBS或細胞懸液0.5 ml，見脾臟輕度漲大。輕壓穿刺口，待無滲血后，將脾回納。給予100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素1 ml沖洗腹腔，預防感染。關腹。在脾內注射4 w后，經心臟取血，留取血清，置于-80℃冰箱保存。取肝組織，置于液氮中快速冷凍，置于-80℃冰箱中保存。

1.4 肝組織OV6和α-SMA檢測 采用免疫組織化學法，將肝組織切片經60℃烘烤，二甲苯、乙醇脫蠟復水，0.01%枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復2 min，自然冷卻，滴加3%過氧化氫溶液，37℃孵育15 min，去除內源性過氧化物酶，分別滴加兔抗OV6多克隆抗體（工作濃度1:100）、兔抗α-SMA多克隆抗體（工作濃度1:100），4℃過夜，滴加即用型Maxvision試劑（福州邁新生物技術開發有限公司），室溫15 min，DAB（福州邁新生物技術開發有限公司）顯色2～5 min，蘇木素復染30 s，脫水、透明、封片。在光鏡下觀察、攝片。同時，每張切片隨機取5個視野，采用Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件測定細胞染色陽性比例。

1.5 肝組織α-SMA和TIMP-1表達檢測 采用Western blot法，取肝組織20 mg，加蛋白裂解液1 ml，4℃研磨成勻漿，經離心分離制備蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒定量，每組取總蛋白20 μg上樣，12%SDS-PAGE分離蛋白質，濕轉恒流300 mA 70 min，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入抗α-SMA（1:1000）和抗 TIMP-1（1:1000），4℃孵育過夜，充分洗滌，分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（1：9 000）、兔抗小鼠第二抗體（1：8 000），室溫孵育 1 h，充分洗滌后，發光、顯影、定影、曝光、掃描，以α-肌動蛋白（α-actin）為內參照。α-actin用洗膜液（42℃，30 min）洗膜，重新封閉、先后加入一抗（1：4000稀釋）、二抗孵育。用掃描儀將硝酸纖維素膜上的蛋白條帶掃描至計算機，應用Gel Pro Analyzer software 4.0軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達值。

1.6 血清檢測 采用ELISA法檢測Ⅰ型膠原水平；常規檢測ALT和ALB。

1.7 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件完成統計學處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用Pearson法進行相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝組織α-SMA和OV-6表達情況 正常肝組織α-SMA表達陽性的細胞為平滑肌細胞，有少量OV6表達陽性的細胞位于膽管附近；在模型組肝組織壞死區周圍有大量α-SMA表達陽性的HSCs（即活化的HSC），在匯管區周圍有大量OV6表達陽性的HPCs。隨纖維化程度增加，α-SMA陽性細胞數量逐漸增加，在CCl4腹腔注射 0 w、4 w、8 w和 12 w，α-SMA陽性率分別為（2.1±0.3）% 、（15.4±4.4）% 、（30.1±4.1）% 、（44.1±7.2）%（P＜0.05），OV6陽性細胞數量隨造模時間逐漸升高而后下降，OV6陽性率分別為（2.2±0.30）%、（10.3±1.4）% 、（2 5.5±5.1）% 、（12.6±2.2）%（P＜0.05，圖 1）。

2.2 大鼠肝組織病理學變化 自發逆轉組肝組織有炎細胞浸潤伴假小葉形成，HPCs移植組可見纖維間隔變細，膠原纖維自匯管區或中央靜脈延伸明顯，未包繞整個肝小葉；天狼猩紅染色發現，與自發逆轉組比，脾內HPCs移植組肝纖維化程度減輕，膠原面積縮小，兩組間差異有統計學意義（圖2）。

2.3 大鼠肝組織和血清與纖維化相關指標變化 自發逆轉組肝組織α-SMA和TIMP-1蛋白水平顯著高于HPCs移植組；自發逆轉組血清I型膠原水平顯著高于 HPCs移植組（P＜0.05，圖 3）。

2.4 大鼠肝功能指標的變化 自發逆轉組血清ALT水平顯著高于HPCs移植組，白蛋白水平顯著低于HPCs移植組，表明細胞移植不僅能夠減輕CCl4造成的肝損傷，而且能夠改善肝功能。

3 討論

盡管胚胎干細胞或骨髓來源的間充質干細胞有治療纖維化的潛能，但相比之下，肝臟前體細胞的肝臟定向性更強，更容易分化成肝細胞或膽管細胞，是更為理想的治療肝臟疾病的候選細胞[12-14]。研究發現，在肝纖維化時，干細胞表現出類間質細胞樣的特性，表現為內皮細胞的標記物表達減少，而間質細胞的標記物表達增加，同時分泌的細胞外基質也增加，最終加重肝纖維化的進展[15，16]。我們既往的研究也發現TGFβ1能促前體細胞分化成類間質樣細胞，表現為αSMA表達增加，膠原分泌增加，前體細胞失去特有的極性或錨定依賴性等特點，進而獲得間質細胞表型、細胞遷移和合成細胞外基質等間質細胞的功能[17]。最近有研究發現，前體細胞暴露于TGFβ1的不同時間可能影響其對肝纖維化的作用[18]。

圖1 兩組肝組織α-SMA和OV6表達（200×）和陽性細胞百分比 OV6陽性的HPCs數量在CCl4處理8 w時達高峰，α-SMA陽性的HSCs數量隨纖維化程度增加而增加

圖2 兩組肝組織病理學表現（A、B為HE染色，C、D為天狼星紅染色，100×） 與自發逆轉組比，HPCs移植后肝纖維化程度減輕，膠原面積減少

對大鼠和人肝纖維化的研究均發現前體細胞與星狀細胞關系密切。利用大鼠2-AAF/PH及乙酰氨基酚經典誘導前體細胞激活，發現在星狀細胞活化過程中伴隨前體細胞增殖，活化的星狀細胞與卵圓細胞均位于匯管區，且位置毗鄰，隨造模時間延長逐步向小葉內遷移。Lorenzini et al[19]發現在慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者肝纖維化組織和肝臟受損大鼠/小鼠，激活的肝臟前體細胞常與肝星狀細胞伴行，我們既往的研究不但發現在肝纖維化大鼠，前體細胞位于增生的星狀細胞周圍，而且發現前體細胞的變化與星狀細胞的活化及消長有密切關系。因此，我們推測肝纖維化逆轉大鼠在接受HPCs移植后，加速了肝纖維化的逆轉，可能與其抑制了HSCs的活化有關。

圖3 兩組與纖維化相關的指標變化

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