茵梔黃口服液對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脂肪變的保護作用研究*

劉曉琳，信豐智，楊蕊旭，趙澤華，周達，潘勤，范建高

NAFLD包括單純性非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）[1-2]。雖然前者可通過飲食控制和運動鍛煉來逆轉，但NASH有進展為肝硬化和肝細胞癌的風險[3]。茵梔黃口服液的主要成分是茵陳、梔子、黃芩和金銀花的提取物，具有清熱解毒、退黃、降酶的功效[4-6]。茵梔黃口服液在臨床上被廣泛用于自身免疫性肝炎和新生兒黃疸等疾病的治療[7]。有研究報道，在四氯化碳誘導的急性肝損傷小鼠和卡介苗聯合脂多糖誘導的免疫性肝損傷小鼠，茵梔黃口服液均可有效地降低血清轉氨酶和膽紅素水平[8-10]。本研究旨在觀察茵梔黃口服液對蛋氨酸膽堿缺乏（methionine and choline deficient，MCD）飲食誘導的NASH大鼠血清學和肝組織病理學變化的改善情況。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 30只6周齡SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，標準飼料和MCD飼料購自江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司，茵梔黃口服液由華潤三九醫藥股份有限公司提供。將30只大鼠隨機分為對照組、MCD組和茵梔黃組，每組10只，飼養于上海睿太莫斯生物科技有限公司，動物房恒溫（24℃±2℃）、恒濕（50%±5%），動物自由進食水。在動物房適應性飼養1 w，給予對照組大鼠標準飼料、給予其余兩組大鼠MCD飼料喂養。在第4 w末，分別給予MCD組和茵梔黃組大鼠生理鹽水和茵梔黃口服液灌胃（15 ml·kg-1），1 次 /d，持續至第8 w末，期間每周測量體質量。在第8 w末，將大鼠隔夜禁食后稱質量，給予戊巴比妥鈉麻醉，采用眼底靜脈叢取血法采集血液，靜置凝固后，3000 g離心10 min，收集血清，分裝后置于-80℃冰箱保存。同時，迅速剪下完整的肝臟，稱取肝質量，切取0.5×0.5×0.5 cm大小的肝組織，置于10%福爾馬林溶液中固定，剩下的肝組織置于液氮中凍存。

1.2 肝組織病理學檢查 根據NAFLD活動度積分（NALFD activity score，NAS）和纖維化評分對大鼠肝組織病理學特征進行評分，其中包括肝細胞脂肪變（0～3分）、小葉內炎癥（0～3分）、肝細胞氣球樣變（0～2分）和肝纖維化（0～4分）。當NAS＜3分，排除NASH，NAS＞4分確診為 NASH，NAS=3或4分，為臨界NASH[11]。

1.3 血清生化指標檢測 使用全自動生化分析儀檢測。

1.4 統計學分析 計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料采用卡方檢驗。應用SPSS 16.0軟件進行數據分析，應用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學作圖。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和肝指數比較 MCD飼料喂養大鼠體質量逐漸降低（圖1A）。至第8 w末，MCD組大鼠體質量為（155.8±3.1）g，顯著低于對照組的（487.2±6.5）g，而茵梔黃口服液灌胃對MCD大鼠體質量無顯著的影響（圖1B）；在第8 w末，MCD組大鼠肝指數為（5.09±0.19）%，顯著高于對照組的【（2.92±0.06）%，P＜0.05】；茵梔黃治療組大鼠肝指數為（4.47±0.18）%，顯著低于 MCD 組（P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.05，圖 1C），提示茵梔黃口服液可顯著改善MCD大鼠肝指數水平。

圖1 各組大鼠體質量和肝指數變化比較

2.2 各組大鼠肝組織病理學變化的比較 在第8 w末，MCD組大鼠肝組織肝細胞呈大泡性脂肪變和炎癥細胞浸潤，而茵梔黃處理組大鼠肝組織病變明顯緩解；MCD組大鼠肝組織出現輕度肝纖維化，而茵梔黃組肝纖維化程度減輕。MCD組大鼠肝臟脂肪變評分都為3分，氣球樣變評分都為2分，小葉內炎癥明顯，因此MCD組大鼠都被診斷為NASH。與MCD組比，茵梔黃灌胃組大鼠肝臟脂肪變評分改善，肝細胞氣球樣變評分顯著降低，小葉炎癥評分顯著降低（表1）。MCD組NAS積分顯著升高，而茵梔黃灌胃組則明顯降低）。MCD組肝纖維化評分顯著升高，而茵梔黃組顯著低于MCD組（圖2）。

圖2 各組大鼠肝組織病理學表現

表1 各組大鼠肝組織病理學評分（±s）比較

表1 各組大鼠肝組織病理學評分（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與 MCD 組比，②P＜0.05

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2.3 各組大鼠血清生化指標比較 因為本研究使用的動物模型為營養缺乏模型，不具有臨床NAFLD患者典型的血脂血糖代謝紊亂表現，所以在該研究中尚未發現茵梔黃口服液對血脂和血糖的顯著改善作用（表2），提示茵梔黃口服液可以顯著降低MCD大鼠血清轉氨酶水平，而對血脂和血糖的影響可能需要高脂誘導的動物模型來證實。

3 討論

本研究采用MCD飲食誘導NASH大鼠模型，探討了茵梔黃口服液對于肝脂肪變大鼠的治療作用，發現茵梔黃口服液可以減輕MCD處理大鼠肝指數，改善NASH的肝臟脂肪變、肝細胞氣球樣變、小葉炎癥和纖維化，同時降低NASH大鼠血清ALT和AST水平。

表2 各組大鼠血生化指標（±s）比較

表2 各組大鼠血生化指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與 MCD 組比，②P＜0.05

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現代藥理學的多項研究結果提示，茵梔黃的主要成分茵陳可促進膽汁酸分泌和排泄，主要用于治療黃疸[12]；梔子苷具有涼血解毒、促進膽汁分泌和活血化瘀的作用[13]；黃芩中的黃芩苷可以抑制脂質過氧化反應，促進膽囊收縮[14]；金銀花自古被譽為清熱解毒的良藥，其中的黃酮可以抗病毒、抗氧化、減輕肝細胞損傷[15]。因此，茵梔黃口服液可以促進膽汁的分泌和排泄，直接參與酶的激活進而影響糖類、脂肪和蛋白質的代謝，同時促進肝臟再生、維持肝細胞的完整性，使其免遭脂質過氧化物的損傷[16]。

肝臟脂肪變、氣球樣變和小葉炎癥（伴或不伴纖維化）是非酒精性脂肪性肝病最典型的病理學特征。我們首次發現茵梔黃口服液可以使MCD誘導大鼠的肝臟脂肪變程度減輕，提示該藥物對于NASH的肝臟脂肪變具有一定的治療療效，這是在其他研究中尚未有報道的。另外，我們的研究也首次發現了茵梔黃口服液可以使MCD大鼠的肝細胞氣球樣變出現一定程度的減輕。同時，與我們的研究結果類似，來自南方醫科大學的團隊研究發現，茵梔黃口服液可以顯著改善肝內膽汁淤積大鼠肝臟炎癥細胞浸潤和壞死性改變，提示茵梔黃口服液可以顯著改善肝病大鼠的肝內炎癥[17]。我們的研究發現茵梔黃口服液可減輕MCD誘導大鼠的肝臟小葉內炎癥，提示該藥也可以用于治療NASH的肝內炎癥。有文獻報道茵梔黃口服液可以用于輔助治療新生兒膽道閉鎖，減少患兒肝纖維化的發生[18]，而目前尚未有茵梔黃口服液對NAFLD誘導的肝纖維化治療有效的報道。我們的研究發現，茵梔黃口服液緩解MCD誘導大鼠的肝臟纖維化的效果非常顯著，給予MCD誘導大鼠茵梔黃口服液灌胃后，其肝臟纖維化程度幾乎可恢復至正常，提示該藥物對NASH大鼠肝臟纖維化病變有一定的治療效果。

已有臨床研究發現，茵梔黃口服液可以改善脂肪肝以及NAFLD患者的血清學指標[6，19]。與這兩項研究結果類似，我們也觀察到茵梔黃口服液可以顯著改善MCD誘導大鼠血清ALT和AST水平，但是我們沒有觀察到該藥對大鼠血清糖脂代謝指標（包括 TC、TG、HDL、LDL和 FBG）有影響。原因可能是因為我們采用的MCD誘導大鼠模型為蛋氨酸和膽堿缺乏的動物模型，雖然可見明顯的肝細胞脂肪變和肝內炎癥，但其體質量顯著下降，不具有臨床NAFLD患者能量過剩狀態以及胰島素抵抗和血脂紊亂的特征，所以無法完全模擬臨床NAFLD患者的代謝紊亂狀態。研究發現茵梔黃口服液可以調控炎癥介質和抑制氧化應激，臨床上已經被廣泛地用來治療新生兒黃疸[20]，但是我們的研究沒有觀察到其對血清TBIL的顯著改善作用，可能與我們使用的MCD誘導大鼠模型和治療時間短有關。本研究使用MCD飼料喂養的大鼠不是典型的膽汁淤積動物模型，所以不具備顯著的膽紅素水平升高的表現，給予MCD誘導大鼠茵梔黃口服液灌胃治療后，可看到動物血清TBIL水平下降，但與其他組比無統計學意義。因臨床上使用中藥治療的療程一般較長，因此延長治療時間可能會使MCD誘導大鼠血清膽紅素下降。

綜上所述，我們的研究發現，茵梔黃口服液可以改善MCD誘導的NASH大鼠的肝臟脂肪變、氣球樣變、小葉炎癥和肝纖維化，降低NASH大鼠血清轉氨酶水平，但未能證實茵梔黃口服液對NASH大鼠血脂和血糖有顯著的影響，后續研究可以通過高脂飼料誘導的大鼠模型來進一步探索和驗證茵梔黃口服液對NAFLD動物糖脂代謝的影響。

【參考文獻】

[1]Younossi ZM，Koenig AB，Abdelatif D，et al.Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence，incidence，and outcomes.Hepatology，2016，64（1）:73-84.

[2]趙澤華，范建高.2016年美國肝病年會非酒精性脂肪性肝病深度報道. 實用肝臟病雜志，2017，20（1）:21-24.

[3]Fan JG，Kim SU，Wong VW.New trends on obesity and NAFLD in Asia.J Hepatol，2017，67（4）:862-873.

[4]趙文霞，張麗慧.合理應用中成藥治療非酒精性脂肪性肝病.實用肝臟病雜志，2017，20（2）:132-134.

[5]李紅山，馮琴，胡義揚，等.脂聯素及其受體在脂肪肝病理機制中的意義及中藥干預作用.中華肝臟病雜志，2009，17（11）：826-830.

[6]劉曉琳，范建高.2017年亞太地區肝病年會非酒精性脂肪性肝病研究報道.實用肝臟病雜志，2017，20（3）:Ⅲ.

[7]Yoon M，Kim MY.The anti-abgiogeni herbal composition Ob-X from morus alba，melissa officinalis，and artemisia capillaries obesity in genetically obese ob/obmice.Pham Biol，2011，49（6）：614-619.

[8]Chen X，Krakauer T，Oppenheim JJ，et a1.An injectable multicomponentchinese herbal medicine，is apotentinhibitorof T-cellactivation.J Altern ComplementMed，2004，10（3）：519-526.

[9]Liu LL，Gong LK，Wang H，et al.Baicalin protects mouse from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of cytokine production and hepatocyte apoptosis.Liver Int，2007，27（4）：582-591.

[10]聞淑軍.茵梔黃口服液治療非酒精性脂肪肝的臨床療效研究.世界中西醫結合雜志，2015，13（11）:1212-1214.

[11]Kleiner DE，Brunt EM，Natta MV，et al.Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology，2005，41（6）:1313-1316.

[12]Hutton EK，Hassan ES.Late vs early clamping of the umbilical cord in full-term neonates：systematic review and metaanalysis of controlled trials.J Am Med Asso，2014，297（11）：124l-1252.

[13]Liang H，Zhang L，Wang H，et al.Inhibitory effect of gardenoside on free fatty acid-induced steatosis in HepG2 hepatocytes.Int J Mol Sci，2015，16（11）:27749-27756.

[14]Dong Q，Chu F，Wu C，et al Scutellaria baicalensis georgi extract protects against alcohol-induced acute liver injury in mice and affects the mechanism of ER stress.Mol Med Rep，2016，13（4）:3052-3062.

[15]Wang MY,Srinivasan M,Dasari S.Antioxidant activity of yichun blue honeysuckle（YBHS） berry bounteracts CCl4-induced toxicity in liverinjury modelofmice.Antioxidants （Basel），2017，6（3）:1-11.

[16]Zeng J，Wang SJ，Li YM，et al.Yinzhihuang oral liquid in the treatmentofneonataljaundice:a meta-analysis.Pharm Biol，2017，55（1）:554-559.

[17]Ou QQ，Qian XH，Li DY，et al.Yinzhihuang attenuates ANIT-induced intrahepatic cholestasis in rats through up-regulation of mrp2 and bsep expressions.Pediat Res，2016，79（4）:589-595.

[18]李騰，齊利峰，于愛真.茵梔黃口服液輔助治療新生兒膽道閉鎖21 例療效研究.中國藥業，2014，15（16）:109-111.

[19]Gao Y，Song LX，Jiang MN，et al.Effects of traditional Chinese medicine on endotoxin and its receptors in rats with non-alcoholic steatohepatitis.Inflammation，2008，31（2）:121-132.

[20]Chen SP，Tian LL，Liu FL.Clinical observation of Yinzhihuang oral liquid on prevention of the premature infantile jaundice.Chin J Integrat Med，2009，15（4）:299-302.