敲減CCAAT/增強子結合蛋白α通過增加O-GlcNAc糖基化水平促進肝癌細胞體外增殖*

李文姣，曹海超，馬瀾婧，張 松，丁美玲，張浩浩，聶勇戰

CCAAT/增強子結合蛋白α（CCAAT/en-hancerbinding protein alpha，C/EBPα）是一種亮氨酸拉鏈蛋白，與能量代謝和細胞分化密切相關[1-5]。研究表明肝臟條件性C/EBPα敲除小鼠存在葡萄糖耐量異常，血清膽固醇減少及肝臟脂肪變，說明C/EBPα在肝臟的糖脂代謝穩態發面發揮著重要的作用[6，7]。很多實體瘤C/EBPα表達下降，包括肝臟、乳腺、肺、前列腺、胰腺、膽囊和胃等[8-10]。臨床研究發現肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者癌和癌旁組織C/EBPα表達下降，并且與腫瘤的進展和患者生存期降低密切相關[11，12]。O-GlcNAc糖基化修飾是一種重要的營養敏感糖修飾，由兩種關鍵的酶乙酰葡糖胺轉移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）利用己糖胺代謝途徑的終產物鳥苷二磷酸氮乙酰葡糖胺（uridine diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-G lc-NAc）來維持O-GlcNAc糖基化修飾的穩態[13，14]。升高的O-GlcNAc糖基化修飾與多種代謝異常相關，如胰島素抵抗、肥胖、糖尿病以及腫瘤相關的代謝重編程[15]。在HCC患者癌組織中O-GlcNAc糖基化修飾表達上調，并與腫瘤的發生進展以及肝移植后的腫瘤復發密切相關[16，17]。本研究發現敲減C/EBPα后在不同葡萄糖濃度下都會促進肝癌細胞的體外增殖，并能下調OGA的表達，從而升高細胞整體的O-GlcNAc糖基化修飾水平。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器 人肝癌細胞Hep3B由國家腫瘤生物重點實驗室提供；胎牛血清（FBS）、Opti-MEM和0.25%胰酶Trypsin購自Gibco公司；高糖DMEM和低糖DMEM購自美國Hyclone公司；青霉素 /鏈霉素（PS）、二甲基亞礬（DMSO）購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自ZETA LIFE公司，逆轉錄試劑盒購自TAKALA公司；化學發光儀、全自動酶標儀（BIO-RAD550）和Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 細胞培養與低糖處理 配制含10%FBS的89%DMEM培養基和1%PS的培養液。當細胞生長至80%～90%時，用0.25%胰酶消化、傳代。接種6孔板，細胞在正常高糖培養基中貼壁生長24 h，用PBS清洗2遍，更換正常高糖（NG，4.5 g/L）或者低糖培養基（LG，1 g/L）。

1.3 慢病毒感染 取對數生長期的Hep3B細胞，將其鋪入24孔板，置于培養箱中，待細胞密度達到50%～60%。將原培養基更換為Opti-MEM，并加入Polybrene至終濃度 5 μg/ml，然后加入靶向C/EBPα的RNAi慢病毒，對照組加入陰性對照病毒。常規培養16 h后，換為原培養液。細胞在感染病毒48～72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞所帶GFP綠色熒光。培養至細胞長滿約90%，轉入6孔板，加入終濃度2 μg/ml嘌呤霉素，篩選1～2 w，每2天換液，待培養液不再有漂浮的死細胞后篩選完畢。

1.4 細胞增殖檢測 使用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活性。

1.5 細胞目標分子mRNA水平檢測 采用qRT-PCR法，用TAKALA總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，定量。在20μl反應體系中，含有總RNA 1000 ng，在 37℃，30 min，85℃，5 s的條件下進行反轉錄，獲得cDNA。采用SYBR green實時定量PCR法檢測目標分子水平。實驗重復3次，用2△△Ct進行數據分析。

1.6 細胞目標分子蛋白表達水平檢測 采用Western blot法，待細胞在正常高糖培基中貼壁后更換低糖培養基，分別培養24 h和48 h，提取總蛋白。經10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉入PVDF膜上，用含有5%TBST的脫脂牛奶室溫孵育1 h，加入抗 C/EBPα（CST，1:1000稀釋）、抗 OGA（abcam，1：1000 稀釋）、抗 O-GlcNAc（novus，1：1000 稀釋），4℃搖床孵育過夜。次日，加TBST洗膜3次，每次5～10 min，加入HRP標記的二抗，室溫搖床孵育1 h，洗膜3次，在化學發光液中顯影，結果用Lmage-lab圖像軟件分析。

1.7 統計學分析 計量資料以±s表示，采用t檢驗。應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，P＜0.05被認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 成功構建C/EBPα敲減Hep3B細胞系 利用RNAi慢病毒感染Hep3B細胞，構建C/EBPα敲減細胞模型。由于重組質粒的靶序列下游帶有綠色熒光蛋白基因，慢病毒感染48 h后在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說明插入的靶序列可以有效轉錄（圖1A）。經嘌呤霉素篩選后，行C/EBPα敲減穩轉細胞系鑒定。qRT-PCR檢測結果顯示，與對照細胞比，RNAi慢病毒感染細胞C/EBPα mRNA水平下調（7.5±2.3）倍（P＜0.05，圖 1B）；Western blot檢測結果顯示，RNAi慢病毒感染細胞C/EBPα蛋白表達水平明顯下調（圖1C），灰度值分析顯示C/EBPα敲減后蛋白表達水平下調了（8.8±0.25）倍（P＜0.001，圖 1D），上述結果證明 C/EBPα 敲減的穩轉細胞系構建成功。

圖1 成功構建C/EBPα敲減Hep3B細胞系

2.2 敲減C/EBPα可促進Hep3B細胞增殖 在我們的細胞培養過程中，發現敲減C/EBPα后細胞的生長速度明顯快于對照組細胞。利用CCK-8實驗測定細胞增殖活性，發現敲減C/EBPα可以促進細胞增殖（圖2A）。在低葡萄糖（LG，1 g/L）條件下刺激48 h和72 h后，敲減C/EBPα分別促進細胞增殖 15.4%（P＜0.05）和 25.0%（P＜0.01，圖 2B）。

圖2 敲減Hep3B細胞增殖加速

2.3 敲減C/EBPα增加O-GlcNAc糖基化修飾 在低葡萄糖刺激24 h和48 h后，敲減C/EBPα可以下調細胞OGA蛋白表達水平（圖3A）。灰度分析顯示，與對照組比，敲減C/EBPα細胞在正常高糖及低糖刺激24 h和48 h時，OGA蛋白表達分別下調了70.1%（P＜0.01）、51.4%（P＜0.05）和 61.2%（P＜0.05，圖3B）。而整體O-GlcNAc糖基化水平高于對照組。灰度分析顯示，在低糖作用48 h時，灰度值升高80.6%（P＜0.05，圖 3C），說明下調 C/EBPα 可以影響細胞整體O-GlcNAc糖基化修飾狀態，而OGA表達下調可以在一定程度上解釋O-GlcNAc糖基化修飾的改變。在正常高糖條件下，敲減C/EBPα后細胞OGA mRNA水平有下調趨勢，但無明顯的統計學差異。當給予低葡萄糖刺激后OGA mRNA水平升高，在48 h時其水平增加了77.4%（P＜0.05，圖3D）。

圖3 敲減C/EBPα增加O-GlcNAc糖基化修飾

3 討論

在本研究中，我們發現敲減C/EBPα后明顯促進了Hep3B肝癌細胞的增殖速率，并且在低葡萄糖的營養狀態下這種促進作用更為明顯。既往研究發現HCC患者癌組織比癌旁組織C/EBPα表達下降，而這種變化與腫瘤轉移和臨床不良預后密切相關，有望成為評價HCC預后的新指標[18，19]。在小鼠肝癌模型，肝臟特異性的C/EBPα敲入可明顯減小瘤體的形成，降低腫瘤的增殖能力[20]。目前，已設計出C/EBPα短激活 RNA（small-activating RNA，saRNA）來增加C/EBPα轉錄水平。在HepG2細胞，轉染C/EBPα的saRNA后細胞白蛋白的分泌可以增加3倍左右，腫瘤細胞的增殖速率降低50%左右。在動物模型中，當給肝硬化伴多病灶肝癌的大鼠尾靜脈注射C/EBPα的saRNA后，大鼠血清白蛋白增加了超過30%，并且谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶都有一定程度的升高。另外，注射C/EBPα saRNA后大鼠的腫瘤負荷降低約80%，并抑制甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的表達[21]。在肝臟原位移植瘤注射C/EBPα的saRNA后可以抑制原位移植瘤的形成以及肝內和遠處肺臟轉移瘤的形成。這些研究為C/EBPα治療HCC提供了新的思路和方法。

本研究發現在C/EBPα敲減后細胞OGA表達下調，整體的O-GlcNAc糖基水平升高。既往研究發現在HCC患者的癌組織O-GlcNAc水平明顯高于癌旁組織，而且在肝移植后復發性HCC組織中O-GlcNAc高于未復發組。OGA是O-GlcNAc糖基化修飾的特異水解酶，OGA的表達降低可以作為肝癌肝移植后是否復發的獨立危險因子。本實驗中，在低糖刺激的條件下OGA mRNA水平明顯升高，說明還存在其他的調節機制調節OGA的表達，這些有待進一步的研究證實。

總的來說，本實驗證實敲減C/EBPα在正常高糖和低糖條件下均可以明顯促進HCC細胞的增殖，敲減C/EBPα后，重要的營養感知因子O-GlcNAc糖基化水平整體升高，OGA表達有所下調，可能是敲減C/EBPα促HCC發生新的作用機制。隨著對于C/EBPα靶向saRNA的研究進展，基于C/EBPα在肝臟能量代謝和肝癌抑制方面的雙重作用，C/EBPα有望成為靶向治療HCC的新靶點。

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