谷子種子DNA快速提取新方法

龐 冰 ，王艷梅 ，郝建平 ,，王陸軍 ，王創(chuàng)云 ，李培良 ，鄧艷芳，周 瓊，李志敏，董永軍，張婷婷，裴成成，牛學(xué)謙

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；3.山西省玉米工程技術(shù)研究中心，山西太原030031；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技信息研究所，山西太原030031）

DNA作為分子試驗(yàn)的基礎(chǔ)，其質(zhì)量的好壞決定著試驗(yàn)的成功與否[1]。隨著SSR，SNP和基因測(cè)序等高通量生物技術(shù)的發(fā)展，農(nóng)作物研究需要檢測(cè)的樣本量顯著增加，所以，能夠在短時(shí)間內(nèi)快速地提取大量高質(zhì)量樣本的DNA，是提高分子試驗(yàn)效率的有效手段[2-4]。

當(dāng)前，谷子DNA提取的主要方法包括SDS（十二烷基磺酸鈉）法、CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法和高鹽提取法等[5-7]。但這幾種提取方法均以植物幼葉為材料，需經(jīng)過(guò)3～7 d的發(fā)芽期，需要進(jìn)行液氮研磨，水浴、異丙醇沉淀耗時(shí)較長(zhǎng)，批量核酸提取工作量繁重[8-10]。

本試驗(yàn)旨在探究直接以谷子種子為材料提取DNA的方法，簡(jiǎn)化操作流程，縮短提取周期，為谷子高通量分子檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

山西省主要谷子種質(zhì)資源及常規(guī)品種如表1所示。

表1 10份材料名稱及地理來(lái)源

1.2 試劑及主要儀器設(shè)備

2%的CTAB分離緩沖液；0.5 mol/L的EDTA；1 mol/L的 Tris-HCl；β-巰基乙醇；TE 緩沖液；氯仿 /異戊醇（24∶1）；異丙醇；瓊脂糖；TAE 緩沖液；乙醇（70%）；GelStain。

高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5810R）；PCR儀（eppendorf）；微量紫外分光光度計(jì)（北京凱奧5600）；電泳儀（北京君意東方JUNYI3000E）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 谷子基因組DNA提取 取種子0.1 g或幼葉50 mg，機(jī)械粉碎；加入 800 μL CTAB 提取液，65 ℃水浴15 min，期間不定期搖勻；加入等體積氯仿/異戊醇，混勻3 min，以12 000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)2次；加入0.8倍體積的異丙醇（-20℃預(yù)冷），置于-20℃放置5 min；取出后12 000 r/min離心1 min，棄上清；加入500 μL的70%乙醇，搖勻；小心將酒精倒出，自然風(fēng)干后加入50 μL含RNase的TE緩沖液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA質(zhì)量檢測(cè) 采用0.8%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)；采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/280值及其質(zhì)量濃度。

1.3.3 SSR-PCR檢測(cè) 引物名稱為 SiGMS462，正向序列：AGGCCCAGTTTAAATGCAAG；反向序列CTAGGAAGCATCATCCTCCG。反應(yīng)體系（20 μL）：DNA模板60ng；10×Buffer（含MgCl2）2μL；2.5mmol/L dNTPs 1 μL；10 mmol/L 引物各 0.5 μL；2.5 U/μL Taq酶 0.1 μL；ddH2O12.9 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94℃30 s，52℃40 s，72℃ 1 min，循環(huán) 35次；72℃延伸10 min。采用0.8%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，120 V電泳45 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子基因組DNA的純度與質(zhì)量濃度分析

采用新方法提取的幼葉DNA質(zhì)量濃度比種子高，但個(gè)體差異較大，最高可達(dá) 4 671.88 ng/μL，最低為 2 530.51 ng/μL，總體趨勢(shì)不穩(wěn)定；新方法提取的種子DNA總體趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定，基本都在2 000～3 000 ng/μL（圖1、表2）。采用新方法提取的種子和幼葉的核酸，A260/280值均處于 1.8～2.0（圖 2）；經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，所得條帶清晰，一致度高，無(wú)拖尾現(xiàn)象，DNA完整性較好（圖3）。說(shuō)明使用新方法提取的種子DNA質(zhì)量與幼葉一致，無(wú)明顯差異。

表2 谷子種子與幼葉基因組DNA紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

2.2SSR-PCR 驗(yàn)證效果

為驗(yàn)證新方法提取的DNA能否用于SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)，采用SSR引物SiGMS462對(duì)所提取的谷子核酸進(jìn)行擴(kuò)增。從圖4可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶清晰，多態(tài)性顯著。表明新方法提取的DNA能夠滿足SSR等分子標(biāo)記檢測(cè)對(duì)DNA質(zhì)量與數(shù)量的要求。

3 討論與結(jié)論

隨著谷子基因組測(cè)序的完成，谷子分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與檢測(cè)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。作為谷子分子標(biāo)記檢測(cè)的第1步，核酸提取的結(jié)果直接影響下游試驗(yàn)，因此，找到一套簡(jiǎn)便、高效的DNA提取方法很有必要[11-13]。近年來(lái)，人們對(duì)于谷子基因組DNA提取方法進(jìn)行了大量的研究，如堿處理法[14]、高溫水煮法[15]、SDS 一步法[16]、TE 研磨法[17]等，這些提取方法速度快、成本低，避免使用液氮研磨、苯酚等有毒化學(xué)試劑，甚至將破碎后的提取液直接作為模板，但都存在所得DNA質(zhì)量不穩(wěn)定，無(wú)法保證后續(xù)分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性[18-20]。并且所用材料多為谷子的幼葉，需要加入β-巰基乙醇等防止氧化，對(duì)人體以及環(huán)境會(huì)造成一定程度的危害[21-22]。

本試驗(yàn)直接以谷子干種子為材料進(jìn)行DNA提取，無(wú)需經(jīng)過(guò)3～7 d的發(fā)苗期，無(wú)需液氮研磨，直接通過(guò)機(jī)械研磨破碎細(xì)胞壁，減少了核酸在異丙醇中的沉淀時(shí)間，提取過(guò)程簡(jiǎn)便、高效。同時(shí)無(wú)需加入苯酚、β-巰基乙醇等對(duì)人體有害的試劑，所獲DNA能夠滿足SSR等分子檢測(cè)試驗(yàn)的需求，為實(shí)現(xiàn)谷子高通量分子檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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