鎘對背角無齒蚌鰓組織抗氧化酶活性的影響

井維鑫，劉 娜，王 蘭

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

隨著經濟的快速發展，鎘成為水系表層沉積物中含量最高的重金屬之一[1]。水生生物通過呼吸、攝食等方式吸收環境中的重金屬，并在體內積累[2]，通過食物鏈進入人體引起慢性中毒，進而影響人類的健康[3-6]。

雙殼類屬于底棲動物，具有極高的濾水速率[7]，可反映水體中重金屬的污染狀況[8]，是監測水體重金屬污染物的有效指示生物[9]。動物組織的金屬含量與生物標志物具有相關性[10]，鰓作為呼吸器官與水環境直接接觸，是毒物的主要靶器官[11]，重金屬通過鰓組織到達其他組織器官[12]。研究表明，鎘通過Ca2+通道穿過細胞膜進入機體，誘導產生大量自由基和活性氧（ROS），ROS與體內脂質、蛋白質和核酸等生物大分子反應，導致脂質過氧化、細胞膜損傷，并影響多種酶的活力，對生物體造成威脅[13]。抗氧化酶是一類監測環境污染或環境變化的重要生物標志物，且在不同環境、不同物種、不同組織均有明顯差異[14]。

本研究采用亞慢性毒性試驗方法，研究鎘暴露和鎘清除后背角無齒蚌（Anodonta woodiana）超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化氫酶（CAT）活性的變化情況，旨在為篩選合適的生物標志物進行重金屬監測提供一定的科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

背角無齒蚌（濕質量為（90.51±20.01）g；體長為（9.08±0.64）cm；殼頂高為（3.82±0.36）cm），購于山西省太原市五龍口水產品批發市場。購回后，用曝氣48 h的自來水清洗，去除表面附著物以及泥沙等雜質。在實驗室條件下（水溫為（14.65±0.31）℃；溶解氧為（9.75±0.26）mg/L；電導率為（6.67±0.32）μS/cm；pH 值為 8.34±0.12），對背角無齒蚌馴養42 d，前21 d不喂食以使體內代謝廢物排出體外，后21 d投喂小球藻（喂食數量為3.5×104個 /只）。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計根據96 hCd2+的LC50（134.9 mg/L）設置高濃度組 1.349 mg/L（1/100 LC50）和低濃度組0.337 mg/L（1/400 LC50）共 2 個鎘（Cd2+）處理組，同時設置1個對照組，每個組選取大小相近且健康的60只蚌進行染毒。

試驗分為2個階段：前28 d為鎘暴露期，即將背角無齒蚌在不同濃度Cd2+溶液中染毒處理28 d；后28 d為鎘清除期，將之前Cd2+染毒處理28 d的背角無齒蚌移入到清水中飼養至56 d。不同試驗階段均是2 d換水一次，每次換水后進行喂食，定時檢查蚌的死亡情況，隨時挑出死亡個體（死亡標準為貝殼長久張開，不閉合，斧足異常伸展，受刺激后不收縮[15]）。

1.2.2 樣品制備 每7 d取材一次，各試驗組隨機取5只蚌，解剖取鰓組織，用濾紙吸凈表面水分，稱質量后用液氮速凍后保存于-80℃冰箱中備用。同時以預冷的PBS緩沖液在冰上制備20%的鰓組織勻漿液，并于4℃下離心，取其上清液，暫保存于冰上。

1.2.3 測定方法 采用羥胺法測定T-SOD、可見光法測定CAT、羥胺法測定GPx、考馬斯亮藍法測定蛋白含量。酶活測定的試劑盒購于南京建成生物工程研究所，抗氧化酶活力與蛋白含量的檢測用多功能酶標儀（SpectraMaxM5，美國MD公司）。

1.3 數據處理

用SPSS 20.0統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），并應用Tukey's test將處理組與對照組進行比較（?表示差異顯著（P＜0.05），?? 表示差異極顯著（P＜0.01））。試驗結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 鎘暴露與鎘清除對背角無齒蚌鰓組織SOD活性的影響

與對照組相比，SOD活性在背角無齒蚌鰓組織鎘暴露期的低濃度組（0.337 mg/L），21，28 d 被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01），但是 7，14 d未被抑制；高濃度組（1.349 mg/L）鎘暴露期被極顯著抑制（P＜0.01），且在 28 d抑制效果最明顯（P＜0.01）。鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）SOD活性在35 d被極顯著抑制（P＜0.01），之后隨著清除時間的延長，SOD活性逐漸恢復至對照組水平；而高濃度組（1.349 mg/L）在鎘清除期內，SOD活性被極顯著抑制（P＜0.01），且在 42 d 達最低值，其低于鎘暴露期的各組水平（圖1）。

2.2 鎘暴露與鎘清除對背角無齒蚌鰓組織GPx活性的影響

在背角無齒蚌鰓組織中，GPx活性與對照組相比，在鎘暴露期，低濃度組（0.337 mg/L）除 21 d 無顯著性差異外，其余各組GPx活性均顯著或極顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；高濃度組（1.349 mg/L）在7 d 被極顯著抑制（P＜0.01），在 14，21，28 d 極顯著或顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），且在 21 d 達到最大值。在鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）在49，56 d 被極顯著誘導（P＜0.01），35，42 d 無顯著性差異；高濃度組（1.349 mg/L）的鰓組織GPx活性，在 35，56 d 組被極顯著誘導（P＜0.01），在 42，49 d無顯著性變化（圖2）。

2.3 鎘暴露與鎘清除對背角無齒蚌鰓組織CAT活性的影響

鎘暴露期低濃度組（0.337 mg/L）背角無齒蚌鰓組織除7 d CAT無顯著性差異外，其他測定時間均被顯著抑制（P＜0.05）；高濃度組（1.349 mg/L）除 7 d無顯著性差異外，14，21，28 d時CAT活性顯著或極顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）除 56 d 無顯著性差異外，各測定時間均被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01）；高濃度組（1.349 mg/L）在 35，56 d 與對照組相比無顯著性差異，42，49 d CAT活性均被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01）。在鎘清除期 56 d，低濃度組、高濃度組CAT活性均恢復至對照組水平（圖3）。

3 討論

鰓是軟體動物的呼吸器官，是污染物作用的早期靶點[16]。在生物體內，只有SOD是一種以自由基為底物的抗氧化酶，具有清除機體內活性氧自由基的作用，從而使細胞免受損害[13，17-18]。研究表明，背角無齒蚌經 4.22～67.45 mg/L Cd2+處理 24 h 后，發現鰓組織SOD被極顯著誘導[19]；經5，50 mg/L Cd2+組脅迫14 d后鰓組織SOD活力顯著升高[20]；5 μg/L Cd2+脅迫30 d后，鰓組織由于氧化應激，SOD活性顯著升高，40 μg/L Cd2+脅迫30 d后，SOD活性顯著下降[12]。本試驗結果發現，SOD活性在試驗測定時間內表現為被抑制，可能是因為動物體長時間暴露在較高濃度Cd2+（0.337，1.349 mg/L）狀態下，體內被誘導產生了較多的超氧陰離子（O2-·），而過多的O2-·影響了SOD基因的表達，進而促使酶蛋白的合成受阻、酶活性下降[21]。

GPx是生物體普遍存在的一種抗氧化物酶。Cd2+與GPx的活性部位硒代（半）胱氨酸（Se-Cys）結合，一方面降低了Cd2+對機體的毒性影響，另一方面導致其活性部位發生改變、GPx失活[22]。此外，Cd2+與GPx前體結合使GPx的合成受到抑制，從而導致H2O2，OH-的積累，使機體受到損傷[23]。文獻調研發現，背角無齒蚌以5 μg/L Cd2+脅迫30 d后，鰓組織GPx活性顯著升高，40 μg/L Cd2+脅迫30 d后，GPx活性與對照組相比無明顯差異[12]；以 4.22～67.45 mg/L Cd2+處理24 h發現，鰓組織GPx活性僅在16.82 mg/L Cd2+處理組表現為顯著升高，其余濃度組與對照組無明顯差異[19]。本試驗在鎘暴露7 d后，高濃度組（1.349 mg/L）活性相對于對照組顯著上升，當處理時間延長，GPx活性略有下降，但相對于對照組仍表現為顯著升高。原因是由于Cd2+進入機體后，導致ROS的大量生成[24]，抑制了SOD的活性，使得機體內H2O2的含量不斷增高，從而刺激機體產生大量的GPx來清除過量的H2O2[25]。

CAT是一種含血紅素的酶，存在于線粒體和抗氧化物酶體中，CAT能迅速分解H2O2，生成H2O和O2[26]。背角無齒蚌用較低濃度（5～40 μg/L）[12]或較高濃度（4.22～67.45 mg/L）[19]Cd2+脅迫后，可極顯著誘導鰓CAT的活性升高。本試驗結果表明，Cd2+在0.337 mg/L 可顯著抑制 CAT活性，1.349 mg/L 可顯著誘導CAT活性升高。當大量的Cd2+進入機體并誘導其產生活性氧自由基時，SOD活性被抑制，進而促使機體內H2O2含量升高[24]。H2O2的升高也誘導了機體內CAT的基因表達及活性，提高H2O2的分解速率[27]。

在試驗鎘清除期56 d，鰓組織SOD活性在低濃度組（0.337 mg/L）恢復至對照組水平，而高濃度組（1.349 mg/L）仍極顯著低于對照組水平（P＜0.01）；鰓組織GPx活性低、高濃度組仍極顯著高于對照組水平（P＜0.01）；鰓組織 CAT活性低、高濃度組均恢復至對照組水平。本研究結果表明，在鎘低濃度污染被清除后，背角無齒蚌具有一定的適應或恢復能力，而當受外界環境高濃度鎘脅迫后，即使這種污染被清除后，機體適應和恢復的能力也極其有限。鎘對背角無齒蚌的健康影響，在很大程度上取決于暴露劑量的高低和暴露時間的長短[28]。

綜上所述，不同濃度鎘暴露后，背角無齒蚌鰓組織SOD活性被抑制，GPx活性被誘導，CAT活性在低濃度組中表現為抑制，在高濃度組中表現為誘導。表明背角無齒蚌機體對鎘污染具有一定的恢復能力。因此，背角無齒蚌抗氧化酶活性的變化能夠反映生物體受污染物脅迫的程度，可作為生物標志物用于指示水體鎘污染狀況。

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