大鼠腦缺血再灌注后GRP78、CHOP表達變化

仇 健，武 菲，王春梅，萬 磊，唐 斌，白 波

臨床上缺血性腦卒中是神經系統常見病和多發病，現正趨向年輕化，腦缺血后相當一部分血管可以自身再通，如短暫性腦缺血發作，也有一部分通過溶栓后再通，但是缺血再灌注損傷時間的長短嚴重影響患者預后的生活質量。動物實驗已經充分證實缺血再灌注后大量神經細胞會受損死亡，而缺血半暗帶的細胞會發生凋亡，為檢測缺血半暗帶凋亡細胞，做了半暗帶取材。內質網應激是細胞凋亡的重要途徑之一，葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)是內質網應激的重要標志物[1]，CHOP是CCAAT/強化結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins homologous protein，CHOP)，是細胞凋亡的重要標志物，檢測標志物對細胞的功能做出客觀的評價。GRP78是熱休克蛋白70家族成員的一份子[2]，生理作用下GRP78在內質網內參與蛋白質的正確折疊，協助蛋白質跨膜轉運，并與蛋白激酶RNA樣內質網激酶(RNA dependent protein kinase like ER kinase，PERK)、活化轉錄因子6 (activating transcription factor 6，ATF6)、肌醇需求酶-1 (inositol-requiring enzyme 1，IRE1)結合，使這些跨膜蛋白處于失活狀態。當各種原因引起的組織細胞內外環境改變時：如缺血缺氧，氧化應激，病毒細菌感染，蛋白質修飾障礙，以及部分腫瘤[3]發生時，GRP78與這三種蛋白解離，促進蛋白質正確折疊，保護細胞。正常情況下，CHOP表達量很低，當細胞受到缺血缺氧刺激或感染持續存在時，CHOP表達上調，CHOP的表達增多會誘發細胞凋亡。該實驗研究缺血2 h再灌注不同時間，GRP78及CHOP表達變化及意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠，體質量(240±10)g，SPF級，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.1.2主要試劑 2，3，5—氯化三苯基四氮唑(TTC)、TEMED購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、疊氮鈉、牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶科技有限公司；增強型化學發光(ECL)工作液購自杭州聯科生物技術有限公司；TUNEL試劑盒購自美國Promega公司；GRP78購自美國Cell Signaling公司；CHOP購自沈陽萬類公司；β-actin、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器 熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；電泳、電轉儀器購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統購自美國Syngene公司；腦立體定位儀購自美國Stoelting公司。

1.2方法

1.2.1模型制作 選取體質量(240±10)g的Wistar雄性大鼠100只，術前禁食禁水，改良線栓法阻塞大鼠右側大腦中動脈模型，術后1.5～2 h大鼠清醒，觀察空懸模型鼠，其前肢是否貼胸壁，貼壁的為成功模型。根據Zea Longa法對大鼠評分，評分標準：0分：無神經損傷；1分：對側肢體不能完全伸展；2分：大鼠在地上旋轉；3分：大鼠傾倒不能行走；4分：大鼠不能行走，意識喪失。0分、4分剔除，然后取合格模型分別再灌注2、12、24 h取材。

1.2.2TTC染色 選用成功大鼠模型取出完整的鼠腦放置-20 ℃冰箱冷凍30 min。用刀片5～6張平均2 mm的冠狀腦片。把切好的腦片放在12孔板，加入2%的TTC溶液，輕微晃動12孔板，使腦片充分與溶液接觸，37 ℃避光孵育5～10 min。用PBS清洗腦片3次，腦片置于4%多聚甲醛溶液中避光過夜固定。梗死區域腦片是白色，正常腦組織顯示紅色。數碼相機拍照，用Image J處理圖片并計算蒼白區域體積占全腦正常組織的百分比。

1.2.3Western blot 將提前備份的各個時間點的腦組織進行分組處理，缺血2 h、缺血2 h再灌注2 h、缺血2 h再灌注12 h、缺血2 h再灌注24 h。用超聲波細胞粉碎機粉碎加有蛋白酶抑制劑(PMSF)和裂解液(RIPA)的腦組織，粉碎后4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA試劑盒測蛋白濃度，加4×上樣緩沖液，混勻后放100 ℃金屬浴10 min。在垂直電泳儀中配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，每個泳道取30 μg蛋白上樣量，電泳分離后轉PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃孵育GRP78(3 ∶5 000)、β-actin(2 ∶5 000)、CHOP(3 ∶5 000)過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，室溫孵育相應的二抗(1 ∶6 000)1 h，TBST洗3次，浸入化學發光液中，暗室曝光。

1.2.4TUNEL染色 選用冰凍腦組織切片厚度為5 μm，技術方法完全遵照說明書。倒置熒光顯微鏡在缺血周邊區和對側相應區域隨機選取三個視野，計算陽性細胞數=(綠色熒光個數/藍色細胞總數)×100%。

2 結果

2.1模型梗死面積的檢測用TTC檢測缺血性腦卒中模型缺血2 h分別再灌注2、6、12、24 h的梗死面積，結果顯示：模型缺血2 h再灌注2、6 h沒出現相應梗死灶，只是損傷側有輕微炎性水腫，當再灌注12 h損傷側腦梗死灶明顯(P<0.001)，炎性水腫明顯，對側沒相應梗死灶到再灌注24 h梗死灶最為顯著且不再變化，見圖1，統計學分析腦梗死灶面積為(19.68±1.75)% (P<0.001)，證明模型成功。

2.2GRP78和CHOP表達檢測Western blot檢測不同時間點GRP78及CHOP的表達，結果顯示腦組織在缺血及缺血再灌注不同時間點較正常組均明顯升高(P<0.05)，GRP78自身對比損傷側較對側明顯升高(P<0.05)，其中缺血2 h再灌注24 h自身對比差異最明顯(P<0.01)，CHOP自身對比損傷側較對側明顯升高(P<0.05)，CHOP在缺血2 h表達升高，并持續至再灌注24 h，其中缺血2 h再灌注12 h時差異有統計學意義。見表1、圖2。

圖1 缺血2 h再灌注24 h腦組織梗死面積

2.3TUNEL檢測缺血模型患側以及健側凋亡細胞的數量結果顯示缺血2 h再灌24 h患側凋亡細胞在梗死區與正常區域交界處明顯增多，統計學分析患側凋亡細胞個數較健側凋亡細胞個數明顯增多，患側凋亡細胞百分比為72.96%±9.16%(P<0.005)。見圖3。

3 討論

GRP78蛋白不僅是內質網應激的標志性產物，在沒外界環境干擾情況下，正常細胞GRP78和CHOP都會微弱表達，當細胞受到感染[4]或理化因素影響時[5]，細胞內GRP78蛋白的含量會相應升高，以維持自身生理功能正常。通常GRP78蛋白持續升高都會對細胞生理產生一定的影響，當理化因素引起GRP78蛋白升高時CHOP也會相應的升高，GRP78 與PERK、ATF6 、IRE1[6]蛋白分離，最常見例子葡萄糖的匱乏、氧量的供給減少，病毒感染，這使細胞GRP78蛋白升高，但CHOP的升高不一定導致細胞凋亡，即便它參與細胞的凋亡過程。細胞凋亡往往有三條途徑：線粒體途徑、內質網途徑、死亡受體途徑，然而線粒體途徑[7]是最主要的途徑，這可能是內質網途徑標志物CHOP升高而不一定發生凋亡的原因之一。

表1 缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶腦組織GRP78、CHOP表達

圖2 缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶腦組織GRP78、CHOP表達

圖3 TUNEL法檢測模型缺血側及健側凋亡細胞結果

當Western blot檢測CHOP表達時，個別大鼠腦組織的GRP78蛋白增高，而相應的CHOP蛋白沒有增高，但對側的CHOP相比患側明顯增高，對側GRP78沒有增高(結果未附)。同時TUNEL檢測患側缺血半暗帶凋亡細胞增多，而對側腦組織未見凋亡細胞。這和宋小燕 等[8]研究顯示，缺血再灌注不同時間點的TUNEL結果一致。但所有模型大鼠對側腦組織均未見凋亡細胞，說明腦缺血再灌注損傷對健側細胞沒有影響。這說明即使CHOP參與了細胞凋亡的途徑，但凋亡細胞也不一定出現，細胞的凋亡可能是很多因素參與的結果，CHOP只能是一個參考。GRP78在短時間的內質網應激中具有保護細胞的作用，長時間的內質網應激即使GRP78持續表達，但不一定對細胞有利，可能促進細胞的凋亡[9]。CHOP的持續升高對細胞的凋亡也有促進作用，短時間的升高不一定能引起細胞的凋亡[10]。本研究顯示缺血2 h GRP78以及CHOP開始升高，GRP78再灌注12、24 h缺血半暗帶GRP78表達量都很高，CHOP在缺血2 h再灌注12 h達到了最高值，并再灌注24 h一直維持高表達狀態。GRP78的峰值和劉楠 等[11]的研究基本一致。個別模型患側Western blot結果CHOP降低但對側CHOP升高，相應的GRP78不高，或許CHOP的升高與患側血流阻斷，對側腦組織血供豐富，代償性代謝旺盛[12]，神經細胞活動增強，細胞器工作加重導致CHOP上調。有報道CHOP不僅參與了細胞的凋亡，也參與巨噬細胞合成細胞因子的炎癥反應[13]，但在缺血再灌注正常側CHOP升高的具體原因目前還不明。

總之，本實驗是探討缺血再灌注不同時間點GRP78與CHOP表達量的關系，短時間的GRP78升高能對細胞有保護作用[14]，CHOP是細胞凋亡的誘導標志物，目前本研究顯示，在腦缺血再灌注損傷模型中，當GRP78和CHOP共同高表達時，細胞的凋亡數目會增多，短時間GRP78或CHOP單一升高則不會引起細胞凋亡。也有文獻[15-16]指出在一些腫瘤細胞內GRP78、CHOP表達也會升高，說明GRP78與CHOP可能參與腫瘤的發生與發展。因此，在不同環境狀態下，GRP78、CHOP的表達高低意義不一定相同。GRP78、CHOP不同時間點表達量的變化也能為后續實驗提供理論支持。

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