SOX9及WNT信號通路分子在高氧暴露致早產大鼠肺損傷中的表達及意義

嚴隆麗，全裕鳳，張 華，柳秋菊，趙日紅，劉 曼

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是新生兒常見的慢性呼吸系統疾病，其發病率隨著胎齡及出生體質量的減少而增加，嚴重威脅到了新生兒的生命及生存質量。研究[1]顯示早產兒肺發育不成熟、長期吸入高濃度氧、感染等是BPD發生的常見原因，但其發病機制仍不明確。目前，越來越多研究[2]表明遺傳因素在BPD的發病中起著重要作用,同時，與高氧肺損傷相關的分子機制也有了較多的研究，但仍然不太完善。WNT信號通路是一條在進化上高度保守的信號傳導通路，對胚胎動物各器官的發育起著關鍵作用，近年來研究[3]證實其在胚胎肺發育過程中起著必不可少的作用，貫穿了整個鼠胚胎肺發育過程。SOX9因子屬于SOX轉錄因子家族，是細胞核內WNT信號通路的調控因子[4]，而有關于高氧暴露后肺組織SOX9表達的變化以及它與WNT信號通路在高氧暴露早產大鼠肺組織中的作用尚未見文獻報道。該研究旨在通過觀察SOX9因子、WNT通路關鍵因子β-連環蛋白(β-catenin)、淋巴增強因子(LEF-1)以及肺泡表面活性蛋白C(SPC)、α-平滑肌激動蛋白(α-SMA)因子在高氧暴露后肺組織中的表達，以了解WNT信號通路是否參與BPD以及SOX9在高氧暴露后肺組織中的表達變化，探討BPD的發病機制，為高氧致BPD的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 用于RT-PCR的試劑主要有TRIzol、逆轉錄試劑盒(北京康為世紀有限公司)，SOX9引物、β-catenin引物、GAPDH引物、LEF-1引物、SPC引物、α-SMA引物(蘇州泓迅生物科技有限公司)；用于Western blot的試劑和儀器主要有RIPA組織細胞裂解液(北京普利萊基因技術有限公司)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(北京索來寶科技有限公司)，PVDF膜(美國密理博公司)，兔抗鼠β-catenin單克隆一抗(美國CST公司)，兔抗鼠SOX9單克隆一抗、兔抗鼠α-SMA單克隆一抗(美國ABCAM公司)，兔抗鼠LEF-1單克隆一抗、兔抗鼠SPC單克隆一抗(北京ORIGENE公司)，鼠抗GAPDH單克隆一抗、山羊抗兔及兔抗鼠單克隆二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，ECL發光液(北京全品速生物科技有限公司)。

1.1.2主要儀器 PCR儀(美國Bio-Rad公司)，JS780 SensiAnsys凝膠圖像分析系統(上海培清科技有限公司)，Tanon4100全自動數碼凝膠成像分析系統(上海天能公司)，ChemiDo-cXRS圖像采集系統(美國Bio-Rad公司)，CYC氧濃度檢測儀及空氧混合器(廣東鴿子公司)。

1.2實驗動物分組和模型制備SPF級健康SD大鼠(8～10周齡)購自桂林醫學院實驗動物中心，雌鼠60只(220～250 g)，雄鼠20只(250～300 g),雌雄按3 ∶1夜間合籠交配，次日晨取雌鼠陰道分泌物涂片鏡檢精子記為受孕第1天，將受孕21 d的大鼠剖宮后取出新生鼠即為早產鼠。早產鼠24 h內隨機分為高氧組(Fio2=95%)和空氣組(Fio2=21%)，每組36只，各組再隨機分為3、5、9 d三個亞組，每組12只，高氧組置于60 cm×50 cm×40 cm的自制氧箱中，持續輸入氧氣,每天3次檢測氧箱內氧濃度，維持氧濃度在95%以上，鈉石灰和無水碳酸鈣分別吸收CO2和水分，每24 h定時開箱0.5 h，添加水、飼料及更換墊料，并與空氣組交換母鼠以避免其因氧中毒致喂養能力下降。

1.3標本收集及處理各組早產大鼠分別于實驗3、5、9 d時用5%水合氯醛按0.006 ml/g進行腹腔注射麻醉。開胸，結扎右支氣管，迅速取下右肺，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。從主支氣管注入4%多聚甲醛維持15 min并置于4%多聚甲醛中過夜固定，逐級乙醇脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，用于檢測肺組織病理變化。

1.4RT-PCR法檢測肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMAmRNA表達將肺組織取出50～100 mg置于用液氮預冷的研缽中，研磨成粉末后加入TRIzol提取總RNA，取5 μl RNA置于含EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測其完整性，用紫外分光光度計檢測其純度和濃度，取肺組織總RNA 1 μg逆轉錄成相應的cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系包括cDNA 2 μl，上下游引物各1μl，無RNA酶水14 μl，PCR 預混合物 2 μl，共20 μl反應體系。SOX9上游引物5′-TCTACTCCACCTTCACCTACAT-3′，下游引物5′-CTGTGTGTAGACGGGTTGTT-3′(擴增產物長度為131 bp)；β-catenin上游引物5′-CAAGCCACAGGACTACAAGAA-3′，下游引物5′-CAATGTCCAGTCCGAGATCAG-3′(擴增產物長度為107 bp)；LEF-1上游引物5′-GGCGACTTAGCAGACATCAA-3′，下游引物5′-CCTGAGAGGACTGTGTTTGTC-3′(擴增產物長度為100 bp)；SPC上游引物5′-GGGTAGCAAAGAGGTACTGATG-3′，下游引物5′-ACCACAACCACGATGAGAAG-3′(擴增產物長度為117 bp)；α-SMA上游引物5′-AGGGAGTGATGGTTGGAATG-3′，下游引物5′-GGTGATGATGCCGTGTTCTA-3′(擴增產物長度為110 bp)；GAPDH 上游引物5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′，下游引物5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3′(擴增產物長度為98 bp)。反應步驟如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，58.3 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個循環，72 ℃終末延伸5 min。反應結束后，分別取10 μl擴增產物加至含有EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，結果通過自動凝膠圖像分析儀顯示并拍照，分別測定條帶光密度值，以GAPDH mRNA的基因表達為內參照，計算SOX9、β-catenin、LEF-1、α-SMA與GAPDH灰度值比，以此值來代表目的基因mRNA的相對表達水平。

1.5Westernblot法檢測肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA蛋白表達取凍存肺組織50 mg于冰上1.5 ml EP管中，剪碎，加入500 μl的RIPA裂解液，超聲3～4次，放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取出上清液即為總蛋白,參考BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書進行蛋白濃度定量，設定濃度最低管為標準，把樣品調成同一濃度，加入樣品溶液，沸水浴加熱15 min后置于冰上冷卻，每孔加40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶室溫封閉4 h后分別加入SOX9一抗、β-catenin一抗、LEF-1一抗、SPC一抗、α-SMA一抗(均按1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min,加入HRP標記的二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫搖動孵育1 h，TBST洗滌3次，用ECL化學試劑發光，曝光1 min，用ChemiDo-cXRS圖像采集系統采集圖像。以GAPDH(1 ∶1 000)作為內參照，Image J軟件檢測條帶灰度值，計算SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA與內參GAPDH的灰度值比值，該比值代表目的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1肺組織病理學改變空氣3 d組、5 d組、9 d組在低倍鏡(×100)下觀察，可見肺組織結構基本正常，肺泡豐富，大小均一，并且隨著出生天數的增加肺泡數量增多。高氧3 d組肺組織見明顯滲出、大量炎癥細胞浸潤、出血性改變及肺泡壓縮，高氧5 d組可見肺組織結構紊亂，肺間質增寬，9 d組可見肺泡炎癥細胞明顯減少，肺間隔明顯增寬，小肺泡減少，肺泡腔增大，肺組織結構紊亂且肺泡結構簡單，見圖1。

2.2肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA的mRNA表達高氧組早產大鼠肺組織β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA在3、5、9 d的mRNA表達均高于空氣組(F=7.705、14.549、9.444、7.974,P<0.05),并且高氧組mRNA相對表達量隨氧暴露時間的增加而增加，SOX9在高氧3、5、9 d mRNA相對表達量呈遞減趨勢，但仍高于空氣組，在3 d和5 d 時，SOX9 mRNA表達與空氣組相比差異有統計學意義(P<0.01),在9 d時，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA的蛋白表達高氧組早產大鼠肺組織β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA的蛋白表達均高于對應時間點的空氣組(F=18.747、87.959、9.281、13.886,P<0.05)，SOX9在高氧3 d、5 d的蛋白表達高于對應時間點的空氣組，差異有統計學意義(P<0.01),在9 d時，高氧組與空氣組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

3 討論

圖1 空氣組和高氧組早產鼠在各時間點的肺組織病理改變 HE×100

圖2 空氣組和高氧組在各時間點SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA mRNA的相對表達

圖3 空氣組和高氧組在各時間點SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA蛋白的相對表達

WNT信號通路是一類控制細胞生長、增殖、傳遞細胞間相互調控信息的信號通路，它主要由經典WNT信號途徑和非經典WNT信號途徑組成。經典WNT信號通路即WNT/β-catenin信號通路，是目前研究最為廣泛的，也是與肺發育密切相關的信號通路，它不僅在肺的早期發育階段調節細胞的增殖和分化，對后期肺結構的維持也是起著重要作用,近年來人們也逐漸認識到它在肺部疾病的發生發展過程中起的重要作用[5]，包括特發性肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、BPD等。目前，已有較多關于經典WNT信號通路與特發性肺纖維化之間關系的研究[6]，而研究WNT信號通路在高氧肺損傷中的作用才剛剛開始。

在WNT/β-catenin途徑中，當細胞外WNT信號分子蛋白與Fz和低密度脂蛋白相關蛋白 5/6結合使胞內蓬亂蛋白發生磷酸化而激活，活化的蓬亂蛋白抑制糖原合成酶3β活性，使β-catenin無法磷酸化，從而避免被泛素-蛋白酶體系降解，β-catenin在胞內富集并進入胞核與 T淋巴細胞因子/淋巴樣增強因子 (TCF/LEF)結合，啟動靶基因轉錄，因此Wnt/β-catenin通路信號活化必然會使β-catenin的表達增加[7]。LEF-1和β-catenin作為經典WNT信號通路中的關鍵轉錄因子，在高氧3、5、9 d組的mRNA和蛋白表達量均高于空氣3、5、9 d組，表明經典WNT信號通路在高氧致BPD模型中是處于激活狀態，提示WNT信號通路參與了高氧肺損傷。

本研究中空氣各組肺組織結構基本正常，高氧3 d組肺組織見明顯滲出、大量炎癥細胞浸潤、出血性改變及肺泡壓縮，高氧5 d組和9 d組可見肺間隔增寬及肺泡結構紊亂，表明成功建立了高氧肺損傷模型。經檢測發現，高氧組肺組織SPC、α-SMA和蛋白表達均高于空氣組，且隨著高氧暴露天數的增加表達量也增加，而空氣各組SPC和α-SMA表達量未見明顯差異。由于SPC是由Ⅱ型肺泡上皮細胞產生的特異性表面活性蛋白[8]，對肺泡結構的完整起著重要作用，因此它在高氧組表達增高提示在高氧情況下Ⅱ型肺泡上皮細胞不斷的增殖,但是向Ⅰ型肺泡上皮細胞分化受阻,導致肺泡的修復受損,代之以纖維細胞的增生來修復, α-SMA是間葉細胞的標志,表達在肌成纖維細胞中[9],因此，高氧組α-SMA表達高于空氣組，且α-SMA在高氧3、5、9 d的表達呈逐漸增高的趨勢，提示隨著高氧暴露時間的增加，肺組織纖維化越來越重，這與病理切片結果相一致。

SOX(SRY_related HMG_box)基因家族是一類編碼轉錄因子的基因,參與多種組織早期胚胎發育過程，對多種組織器官的發育具有重要作用[10]，SOX9是SOXE亞族的一個成員，有研究[11]顯示它表達在呼吸道外周上皮祖細胞中，對肺分支形態的形成起著重要作用，也有研究認為它在呼吸道上皮細胞的表達沒有意義[12]。而有關SOX9與WNT信號通路的關聯在不同的實驗研究中有著不同的結論，在肺腺癌中發現SOX9表達增加與WNT/β-catenin信號通路激活有關[13]；在腸的發育過程中，SOX9被認為是WNT信號通路的直接調控因子[14]；在肺的發育過程中，Rockich et al[11]認為WNT/β-catenin并不調節SOX9的表達；Ustiyan et al[15]在實驗中發現WNT/β-catenin在呼吸道上皮祖細胞中既可促進SOX9的表達，又可抑制SOX9的表達，可見SOX9與WNT信號通路的相互作用非常復雜，而有關SOX9基因功能改變與早產BPD的關系,目前國內外尚未開展這方面的研究。

本研究顯示高氧組SOX9的核酸和蛋白表達量均高于空氣組，以高氧3 d和高氧5 d最為明顯，而高氧3 d組的表達量又高于高氧5 d組，因此推測在高氧致急性肺損傷時，SOX9表達增加可能是應激性增加，是為了抑制WNT信號通路的激活來保護肺不受損害，但是隨著高氧暴露時間的增加，SOX9的表達逐漸降低，也許與SOX9無法抑制WNT/β-catenin信號通路的激活反而被WNT/β-catenin信號通路抑制有關。

綜上所述，本研究顯示高氧暴露通過激活WNT信號通路致早產大鼠肺組織損傷，同時WNT信號通路的激活可能是通過抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞向Ⅰ型肺泡上皮細胞分化，因此肺泡上皮不能正常修復，從而導致肺組織最后纖維化，而SOX9則可能是通過抑制WNT信號通路來參與高氧肺損傷。而有關SOX9及WNT/β-catenin信號通路在高氧肺損傷中的具體機制仍有待進一步研究。

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