雌二醇濃度對(duì)羊膜上子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響

王寶金，付喜玲，杜俊鵬，任琛琛，張 峰，王新月，李 霞

隨著人工流產(chǎn)及宮腔鏡手術(shù)的發(fā)展，子宮內(nèi)膜損傷日益常見(jiàn)。預(yù)防宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)及宮腔粘連分離術(shù)(transcervical resection of adhesions，TCRA)后再粘連成棘手且亟待解決的問(wèn)題。雖然術(shù)后應(yīng)用雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)被廣泛應(yīng)用，但其最佳用量尚無(wú)定論，有報(bào)道[1]稱(chēng)雌激素過(guò)低或過(guò)高均不利于子宮內(nèi)膜修復(fù)。有研究[2]表明新鮮羊膜移植入TCRA術(shù)后的宮腔，能有效降低宮腔再粘連的發(fā)生率，宮腔粘連診治指南也將其作為IB級(jí)推薦[3]，羊膜移植有望成為治療宮腔粘連的新途徑。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells，ESCs)，探討羊膜支架上促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的雌二醇的適宜濃度，以期為雌激素用量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑DMEM-F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(FBS)(美國(guó)Hyclone公司)；Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Invitrogen公司)；兔抗人細(xì)胞波形蛋白抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；熒光定量及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO生物科技有限公司)；17-β雌二醇(美國(guó)Sigma公司)；增殖細(xì)胞抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) mRNA引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在患者知情同意的前提下，取2016年5月～9月因不明原因不孕行診刮術(shù)患者子宮內(nèi)膜組織少許，均經(jīng)病理檢查證實(shí)均為正常增生期內(nèi)膜。患者年齡22～39(31.02±0.23)歲，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未服用過(guò)激素類(lèi)藥物。參照 Arnold et al[4]方法并加以改良:無(wú)菌條件取子宮內(nèi)膜組織剪至糊狀，以0.25% Ⅱ型膠原酶消化40 min后，依次經(jīng)200目、400目細(xì)胞篩網(wǎng)分離出子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，以 1×106/ml密度接種，用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基于含37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)中進(jìn)行培養(yǎng)，融合度達(dá)80%～90%時(shí)傳代。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法以波形蛋白抗體為一抗、PBS代替一抗作為陰性對(duì)照鑒定第3代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，以顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)未著色為陰性。

1.3新鮮羊膜的制備參照Lee et al[5]的方法，無(wú)菌條件下鈍性分離法取正常足月剖宮產(chǎn)羊膜。用胰酶消化后羊膜上皮面朝上，用自制刮刀輕柔刮除羊膜上皮細(xì)胞，顯微鏡顯示刮除干凈后將羊膜剪成6孔板大小。羊膜基質(zhì)面朝上鋪于6 孔板中，于培養(yǎng)箱中干燥數(shù)分鐘待用。

1.4細(xì)胞接種與雌二醇處理將生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞接種于羊膜基質(zhì)面的作為實(shí)驗(yàn)組，接種于普通培養(yǎng)基對(duì)照組。更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h后。參照白曉霞 等[6]研究，按加入雌激素濃度進(jìn)行分組，未加入雌二醇組為A組，余各組分別加入不同濃度的17-β 雌二醇(mol/L)：1×10-8(B組)、1×10-7(C組)、1×10-6(D組)、1×10-5(E組)，將細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

1.5CCK-8法測(cè)細(xì)胞增殖率48孔板接種細(xì)胞2×105個(gè)/孔，采用CCK-8法測(cè)普通培養(yǎng)基及羊膜支架上細(xì)胞OD值并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。計(jì)算不同濃度雌二醇處理后各組細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率(%) = (OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組) ×100% 。

1.6RT-PCR法測(cè)PCNAmRNA的相對(duì)表達(dá)量以1×106/ml密度將細(xì)胞接種于6孔板中，提取各組細(xì)胞總RNA。目的基因引物序列F:5′-TCTGAGGGCGTTCGACACCTA-3′，R:5′-CGCGTTATCTTCGGCCCTTA-3′，內(nèi)參引物序列F:5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，R:5′-CTGGAAGGTGGACAG-CGAGG-3′。所用引物均由上海生工有限公司合成，參照逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒說(shuō)明，PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算在各組細(xì)胞中PCNA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞鑒定子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞大小不一，細(xì)胞接種后2 h開(kāi)始貼壁，12 h后開(kāi)始生長(zhǎng)延伸，24 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，呈類(lèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)，兩頭尖中間稍寬，呈紡錘狀。4～5 d融合度可達(dá)80%～90%，8～9 d出現(xiàn)凋亡跡象，可傳至7～10代，見(jiàn)圖1A、1B。羊膜支架上的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞接2 h后開(kāi)始貼壁，與普通培養(yǎng)基中的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞比較，形態(tài)更細(xì)長(zhǎng)，貼附更強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)更好，細(xì)胞之間連接更緊密，但細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞拉伸延長(zhǎng)并相互交織成網(wǎng)狀，見(jiàn)圖1C、1D，10 d左右羊膜支架出現(xiàn)皺縮趨勢(shì)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)波形蛋白陽(yáng)性，胞質(zhì)呈棕黃色；PBS作為一抗時(shí)陰性，胞質(zhì)未著色，胞核呈藍(lán)紫色，可證實(shí)培養(yǎng)的為子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖1E、1F。

2.2細(xì)胞增殖率設(shè)α=0.10為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，球形檢驗(yàn)的P>0.01(對(duì)照組P=0.837，實(shí)驗(yàn)組P=0.123)，故沒(méi)有足夠的證據(jù)可以否認(rèn)該資料符合重復(fù)資料的方差分析條件。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后，同一時(shí)間點(diǎn)A、B、C、D、E組5組間細(xì)胞增殖率兩兩比較結(jié)果提示：A組增殖率低于B、C、D、E組，D組增殖率高于A、B、C、E組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B、C、E組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明各濃度雌二醇均促進(jìn)細(xì)胞增殖，且以10-6mol/L組增殖最明顯，而不與濃度成正比；方差分析結(jié)果表明：同一雌激素濃度，隨著雌二醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且兩相鄰時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1；相同濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組增殖率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、3。

圖1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

表1 不同濃度雌二醇作用對(duì)照組及羊膜組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖率

表2 不同濃度雌二醇作用后對(duì)照組及羊膜組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3PCNAmRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)α=0.10為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，球形檢驗(yàn)的P>0.01(對(duì)照組P=0.171，實(shí)驗(yàn)組P=0.314)，故沒(méi)有足夠的證據(jù)可以否認(rèn)該資料符合重復(fù)資料的方差分析條件。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后，同一時(shí)間點(diǎn)A、B、C、D、E組5組間細(xì)胞PCNA mRNA表達(dá)兩兩比較結(jié)果提示：A組低于B、C、D、E組，D組高于A、B、C、E組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B、C、E組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明各濃度雌激素均促進(jìn)細(xì)胞PCNA mRNA表達(dá)，且以10-6mo/L組PCNA mRNA表達(dá)最高，而不與濃度成正比，見(jiàn)表2；同一雌二醇濃度，隨著雌二醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PCNA mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且兩相鄰時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相同濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PCNA mRNA表達(dá)的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。結(jié)果與CCK-8細(xì)胞增殖率結(jié)果一致。

3 討論

宮腔粘連作為目前女性繼發(fā)不孕的第二大病因，是嚴(yán)重影響生育期女性生殖健康的常見(jiàn)疾病之一。TCRA為治療IUA的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式，術(shù)后雖輔以人工周期及物理屏障介質(zhì)等，但因?qū)m腔創(chuàng)面大，殘留正常內(nèi)膜組織較少，手術(shù)創(chuàng)面易形成纖維瘢痕愈合造成再粘連的發(fā)生。重度IUA再粘連率高達(dá)62.5%,妊娠成功率僅22.5%～33.3%，宮腔粘連及宮腔鏡術(shù)后再粘連棘手且亟待解決。

圖3 不同濃度雌二醇作用對(duì)照組及羊膜組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖

圖4 不同濃度雌二醇作用后對(duì)照組及羊膜組組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)量

羊膜因具有免疫原性低、減輕炎癥反應(yīng)、分泌生物活性物質(zhì)、抑制纖維組織增生、干細(xì)胞分化的多潛能性等特性[7]，在眼科及燒傷科的應(yīng)用可促進(jìn)上皮修復(fù)及減少瘢痕增生[8]。羊膜也被應(yīng)用于陰道成形術(shù)、宮頸形成及剖宮產(chǎn)術(shù)后切口修復(fù)等。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試將羊膜用于在宮腔粘連，王欣等[9 -10]將羊膜包裹于Foley 球囊表面，放入TCRA后的宮腔內(nèi)，再粘連率減低并明顯改善月經(jīng)量且增加妊娠率，顯示了羊膜在治療IUA的前景。本研究提示羊膜支架上ESCs的增殖率及PCNA mRNA表達(dá)均高于同濃度雌激素時(shí)普通培養(yǎng)基上細(xì)胞水平，羊膜可通過(guò)促進(jìn)ESCs的增殖促進(jìn)損傷子宮內(nèi)膜的修復(fù)。由于Foley 球囊與宮腔形態(tài)不一致，不能完全阻隔創(chuàng)面，且可造成局部?jī)?nèi)膜受壓壞死，設(shè)想將羊膜包裹于宮型球囊表面置于宮腔更有利于子宮內(nèi)膜修復(fù)。

子宮內(nèi)膜細(xì)胞由上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成，基質(zhì)細(xì)胞對(duì)上皮細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)和功能方面發(fā)揮著重要的作用，因此ESCs對(duì)子宮內(nèi)膜的修復(fù)起決定作用。增生期子宮內(nèi)膜以ESCs為主，我們收集增生期內(nèi)膜提高了ESCs的產(chǎn)量及純度。PCNA 是真核生物復(fù)制復(fù)合體的核心成分，通過(guò)不同調(diào)控方式與多種細(xì)胞因子作用，參與了DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等重要的細(xì)胞事件，已成為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的常用指標(biāo)[11]。

雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞有絲分裂，刺激殘存的子宮內(nèi)膜增殖，加快裸露區(qū)的上皮化防止粘連發(fā)生。但雌激素用量及時(shí)間尚不能統(tǒng)一，臨床用量1～16 mg不等。Vollmert et al[12]認(rèn)為宮腔重度粘連術(shù)后子宮內(nèi)膜嚴(yán)重缺損，對(duì)雌激素反應(yīng)降低，大劑量雌激素才可達(dá)到促進(jìn)內(nèi)膜修復(fù)的有效劑量。然而，成九梅 等[13]發(fā)現(xiàn)高雌激素狀態(tài)可使血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (TGF-β1)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)等成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子升高，使子宮內(nèi)膜纖維化而加重宮腔粘連。本研究顯示雌二醇可促進(jìn)ESCs增殖且不隨著濃度的升高而升高，而是以1×10-6mol/L濃度時(shí)最高；隨著雌激素作用時(shí)間延長(zhǎng)，ESCs的增殖率及PCNA mRNA表達(dá)增高；羊膜支架上ESCs增殖優(yōu)于普通培養(yǎng)基上，說(shuō)明羊膜可促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)且羊膜移植術(shù)后雌激素?zé)o需減量。現(xiàn)臨床雌激素給藥途徑多樣化，陰道用雌激素局部血藥濃度高，全身影響小，表現(xiàn)了極大的優(yōu)勢(shì)，TCRA術(shù)后陰道用藥或可減輕藥物副作用。

綜上所述，羊膜聯(lián)合適宜劑量的雌激素應(yīng)用可促進(jìn)ESCs的增殖，加快損傷子宮內(nèi)膜的修復(fù)，但過(guò)高的雌激素環(huán)境是無(wú)益的。本研究為羊膜及雌激素在預(yù)防宮腔粘連的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。然而，女性性激素分泌受垂體-下丘腦-卵巢軸的調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證；羊膜為外來(lái)的載體，其修復(fù)組織的機(jī)制尚未明確，且該技術(shù)尚不成熟；羊膜移植及雌激素用量對(duì)子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局的影響更有待進(jìn)一步深入研究。

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