肺炎支原體肺炎患兒外周血及小鼠模型miRNAs差異表達

許長娣，周 瑤，趙德育，劉 峰

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是介于病毒與細菌之間的一種病原微生物，其引起的肺炎支原體肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia, MPP)是兒童常見呼吸道感染疾病。有資料指出，兒童社區獲得性肺炎中支原體肺炎占10%～40%[1-2]。MPP臨床可表現易復發或遷延不愈，重癥病例還可合并肺外組織器官病變，對兒童健康危害嚴重。目前認為機體在感染MP后通過激活免疫細胞產生多種炎癥因子，通過免疫應答介導和調節免疫功能及炎癥反應，導致MPP的發生和發展，但具體分子機制不明。

近年來，miRNA已作為一類全新的基因調控分子被研究者所認識。miRNA是一類進化上非常保守的內源性非編碼短鏈的小RNA，已有研究表明它可以參與多種疾病的發生發展，有研究[3]證實抑制miR-221表達后哮喘小鼠模型中氣道炎癥反應減輕。目前miRNA在支原體肺炎的表達報道較少。本研究前期通過康城公司的miRNA芯片技術篩選MPP患兒和正常兒童血液淋巴細胞中存在差異表達的miRNAs，利用信息數據庫選取參與炎癥因子調控的存在差異表達顯著的miRNAs，并通過RT-PCR方法驗證芯片檢測結果的準確性，同時在MP感染動物模型肺組織中進一步驗證，為今后的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1資料

1.1.1病例資料 病例均選自2016年3～8月在南京兒童醫院呼吸科病房住院并確診的MPP患兒。診斷標準參考第7版實用兒科學有關MPP的標準[4]：符合社區獲得性肺炎診斷的前提下，滿足以下標準之一：① MP-IgM陽性或恢復期MP-IgG滴度升高4倍及其以上；② 痰FQ-MP-DNA陽性，且≥1×104copies/ml。排除常見的其他細菌和病毒感染，不伴有肺結核、支氣管哮喘等其他呼吸系統疾病且留取標本前未使用大環內酯類、糖皮質激素及免疫調節劑。疾病組24例，其中男12例，女12例；年齡2～14(4.5±1.2)歲。正常組24例，男12例，女12例；年齡1～9(5.5±1.7)歲；均為同期在南京兒童醫院外科準備行擇期手術住院的患兒，近期無感染和慢性疾病史，且排除過敏性和免疫相關性疾病。其家長均知情同意并征得醫院倫理委員會同意。經檢驗，兩組間年齡、性別、體質量差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.1.2動物模型資料 選用生后3周齡BALB/c小鼠24只，雌雄各半，置于SPF級動物室飼養1周，體質量(14.89±2.31)g。

1.2方法

1.2.1人外周血淋巴細胞的分離 疾病組及正常組患兒均于入院次日清晨采2 ml新鮮抗凝血，采用人外周血淋巴細胞分離液，分離收集淋巴細胞，加TRIzol后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2MP感染模型建立及標本留取 將小鼠稱重，腹腔注射4%水合氯醛 0.1 ml/10 g，固定小鼠于動物手術臺上，置于超凈工作臺中，戴無菌手套，抬高鼠板頭端，干預組每只小鼠滴鼻接種濃度為108CFU/ml MP菌液20 μl，隨小鼠的自然呼吸動作MP菌液到達下呼吸道，空白組予等量滅菌生理鹽水滴鼻吸入，滴注后豎起動物固定板，保持小鼠直立體位，直至恢復正常呼吸，頭部稍高(以防胃內容物誤吸)放置至小鼠蘇醒。在干預第4天，處死小鼠。留取小鼠肺泡灌洗液(BALF)，離心后棄上清液，取沉淀提取DNA，同時留取小鼠肺組織切片做組織病理學檢測，并留取肺組織RNA以做進一步檢測。

1.2.3基因芯片 委托上海康成生物公司完成miRNA的芯片檢測。

1.2.4小鼠肺組織病理 取小鼠右肺下葉置入 4%甲醛溶液固定，后經石蠟包埋、切片、HE 染色，進行組織病理學觀察。

1.2.5實時定量PCR 使用實時定量 PCR 試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)進行小鼠BALF沉淀物中MP DNA定量檢測，采用實時定量PCR試劑盒(SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，瑞士Roche公司)進行小鼠肺組織相關miRNA定量檢測，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。各樣品的MP-DNA及目的miRNA的測定，數據采用2-ΔΔct法進行分析。

1.3統計學處理

1.3.1芯片結果統計學分析 中值校正法獲得校正后的標準化數值，標準化數據值=原始值-背景值/中位數。差異基因篩選軟件為Significance Analysis of Microarrays(SAM，version 2.1)。

2 結果

2.1疾病組患兒與正常組兒童外周血淋巴細胞中差異表達的miRNAs通過miRNA芯片檢測，將MPP患兒外周血淋巴細胞中miRNA基因的表達與正常兒童相比，初步篩選出105個表達上調的miRNA基因和133個表達下調的基因(P<0.05)。其中在表達差異較大的miRNAs中，利用信息數據庫選取參與炎癥因子調控的miRNAs，進一步采用實時定量PCR驗證，結果如圖1所示，miR-126、miR-181、miR-146a表達量相對升高(t=14.52、9.92、8.50)，miR-155表達量相對降低(t=-8.93)。

圖1 疾病組患兒與正常組兒童外周血淋巴細胞中miRNAs的表達差異(n=12)

2.2驗證miRNA在支原體感染小鼠肺組織中的表達小鼠肺組織病理結果顯示，MP感染4 d后干預組小鼠肺泡間隔明顯增寬，支氣管和血管周圍可見炎癥細胞浸潤，同時杯狀細胞增生明顯，見圖2A。進一步通過PCR檢測發現干預組小鼠BALF中MP DNA的相對表達量明顯高于空白組(t=7.31)，見圖2B，提示模型構造成功。實時定量PCR檢測顯示，在干預組小鼠肺組織中，miR-126、miR-181、miR-146a相對表達均有不同程度的升高(t=9.75、7.63、8.74)，而miR-155的相對表達降低(t=-7.83)。這與前一結果的趨勢基本一致，見圖2C。

3 討論

目前MPP已成為兒童的常見病，由于病程較長，癥狀較重，易引發多種肺外并發癥而越來越受到關注。但MPP引起的炎癥反應的發生機制尚不十分清楚。目前認為MPP是免疫機制參與的全身性疾病，免疫細胞及細胞因子在免疫損傷中占主導地位[5]，而其中引起病理變化的分子機制并不十分明確。本研究通過miRNA芯片檢測發現在MPP患兒外周血淋巴細胞中miRNA存在表達差異，提示miRNA可能參與MPP的發生發展。在這些miRNA中，本課題組經過進一步PCR驗證發現miR-126、miR-181、miR-146a相對表達量不同程度的上調，miR-155相對表達量下降，結果與芯片趨勢一致。為了進一步驗證MP感染對肺組織局部miRNA表達的影響，本研究構建了MP感染小鼠模型，通過組織病理及肺泡灌洗液中沉淀物內MP-DNA測定均驗證了模型構建成功。通過PCR檢測顯示MP呼吸道感染后小鼠肺組織內上述4個miRNA均有類似改變，進一步提示其可能參與MPP的發生發展。

圖2 miRNA在支原體感染小鼠肺組織中的表達

A:小鼠肺組織病理學變化; B：小鼠BALF中MP DNA相對拷貝數變化；C：小鼠肺組織中miR-126、miR-181、miR-146a、miR-155表達變化；a：空白組；b：干預組；與空白組比較：*P<0.05

有研究[6]已指出miRNA可以參與炎癥的發展，如let-7家族通過抑制IL-13的表達，對IL-13的分泌及TH2細胞介導的炎癥反應起著主要的調控作用；肺部炎癥損傷時，miR-127表達水平下調， 而增強miR-127的表達可抑制巨噬細胞釋放細胞因子[7]。已知機體在感染MP后通過激活免疫細胞產生多種炎癥因子，通過免疫應答介導和調節免疫功能及炎癥反應，導致MPP的發生和發展。本研究顯示 miR-126、miR-181、miR-146a、miR-155在MPP患者血清中及MP呼吸道感染小鼠肺組織中存在差異表達，提示以上miRNA可能參與MPP的疾病發展。現有研究指出，miR-126表達抑制后可以減少氣道炎癥反應，減輕氣道高反應性，減少嗜酸性粒細胞及中性粒細胞在肺泡灌洗液及肺組織的浸潤，同時抑制TH2細胞，減少炎癥因子IL-5、IL-13的釋放[8]。哮喘患者氣道上皮和血漿中miR-181表達水平與哮喘的嗜酸性粒細胞炎癥程度有明顯相關性，提示該miRNA可能參與了氣道嗜酸性粒細胞炎癥。miR-146a的抑制劑可增加IL-1β誘導IL-8和趨化因子的釋放，而miR-146a的模擬物則能發揮抑制作用，表明miR-146a可以負性調節IL-1β誘導的炎癥反應[9]。miR-155可調節人類巨噬細胞對IL-13的反應，其靶向基因是IL-13α1，通過調控IL-13通路，進而使TH1/TH2平衡向TH1方向傾斜[10]。以上均提示這些miRNA分子可能在MPP疾病過程中參與的炎癥反應，值得進一步探索。

本研究通過前期芯片技術的篩選以及后期RT-PCR方法驗證，發現在MPP中，miR-126、 miR-181、 miR-146a表達上調，miR-155表達下降，而這些miRNAs在此前文獻報道中已提示與炎癥反應及炎性介質釋放有不同程度的相關性，故提示它們可能通過調節炎癥因子及炎癥介質的釋放參與疾病的發生發展，為MPP的進一步研究提供了理論基礎。

參考文獻

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