ADAM17-shRNA轉染的BMSCs對乳腺癌移植瘤ADAM17、EGFR和Ki-67的影響

賈文婷，陳國福，張雪鵬, 張笑博，孫 影，趙 瑩

女性多發的惡性腫瘤之一乳腺癌，其治療領域研究的熱點基因靶向治療日趨顯露頭角[1]。其中沉默解聚素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloprotease 17,ADAM17)靶點研究最為深入。RNAi技術下調ADAM17表達，可以逆轉乳腺癌細胞的惡性性狀[2]。該課題組前期實驗證明ADAM17-shRNA可有效地抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲能力并抑制荷瘤鼠乳腺癌細胞和動物水平的生長[3-4]。骨髓間充質干細胞(bone mesenehymal stem cells, BMSCs)是一種干細胞，可轉染外源基因，定向歸巢至機體腫瘤形成部位，使外源基因靶向表達，從而達到治療效果[5]。該實驗利用裸小鼠乳腺癌荷瘤模型，慢病毒介導將ADAM17-shRNA轉染BMSCs，并通過尾靜脈注射入裸小鼠體內，觀察裸小鼠的生長狀態并記錄移植瘤的體積。HE染色觀察各組裸鼠瘤體形態特征；免疫組化法檢測各組瘤體ADAM17、表皮細胞生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和細胞增殖核抗原Ki-67(cell proliferating nuclear antigen Ki-67，Ki-67)的表達，為以ADAM17為靶點的乳腺癌靶向治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1主要材料30只雌性BALB/c-nu/nu裸小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，3周齡，16～20 g；25只雄性SD大鼠購自中國軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，3周齡，60～80 g。在SPF級屏障環境飼養室中飼養，26～28 ℃恒溫，40%～60%相對濕度，實驗操作人員經過嚴格的無菌培訓，飲用水、墊料、籠具均經消毒處理，飼料經高壓滅菌處理，每日光照維持10、14 h無光的明暗周期。慢病毒ADAM17-shRNA-RFP由上海吉瑪制藥技術有限公司設計與合成。人乳腺癌細胞(michigan cancer foundation-7,MCF-7)細胞株購自中國醫學科學院天津血液研究所。

1.2BMSCs的分離、培養及慢病毒載體的轉染將25只SD大鼠，用脫頸法處死，在75%的酒精中浸泡10 min，股骨取出后，剪斷其兩端，暴露骨髓腔，用空白培養液沖洗已分離股骨髓腔，收集骨髓細胞懸液。2 000 r/min離心20 min，棄上清液，用15% 胎牛血清的低糖DMEM細胞培養液制備成單細胞懸液。隨后加入培養瓶中，添加含15% FBS、1%雙抗的低糖DMEM培養液，置于培養箱中常規培養。24 h后進行第一次半定量換液，72 h后進行常規全量換液，之后大約每隔3～5 d換液1次。取第3代對數生長期BMSCs，制備成單細胞懸液，接種于共聚焦小皿上，按照慢病毒轉染說明書操作，以感染復數=5，于共聚焦小皿中加入重組慢病毒轉染液8～10 μl，放入獨立的培養箱中培養。24 h后換液，72 h后在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察BMSCs的生長及轉染情況。

1.3建立裸鼠乳腺癌動物模型及治療常規培養人MCF-7細胞。選取3周齡的裸小鼠，從飼養第3天開始，每日向裸小鼠腹腔內注射雌激素0.2 ml/只(0.15 mg/ml)，直至處死裸鼠取標本；注射雌激素3 d后，開始用1 ml無菌注射器將現制的MCF-7細胞懸液按0.2 ml/只(5×107/ml)注射于裸小鼠右側鼷皮下。每天檢查其精神狀態、飲食和活動、注射部位的感染情況以及移植瘤的生長情況。MCF-7細胞接種14 d后，30只裸鼠荷瘤瘤結節直徑7 mm左右，裸鼠乳腺癌荷瘤動物模型構建成功。行靶向治療，將30只裸小鼠隨機分為轉染組(注射1×106/ml轉染ADAM17-shRNA的BMSCs)、BMSCs組(注射1×106/ml BMSCs)和對照組(注射空白PBS)。按照上述分組，采用無菌微量注射器通過尾靜脈注射BMSCs和轉染ADAM17-shRNA的BMSCs，0.1 ml/次，每3 d重復給藥一次，共5次。從第10天開始每日定時測量荷瘤的體積大小，記錄數值，并算出移植瘤的體積以及最大抑瘤率：抑瘤率(%)=(1-實驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積)×100%，并觀察各組裸鼠的精神狀態，飲食和活動度變化情況。治療16 d后均采用脫頸法處死。

1.4腫瘤組織處理在超凈臺內，采用無菌手術器械分離瘤體，將瘤體組織置于4%多聚甲醛固定液中固定，然后石蠟包埋備用，待進行后續實驗。

1.5蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining，HE) 取出包埋蠟塊，固定在切片機上連續切片，切片厚度為4.5 μm，60 ℃恒溫箱中烤片4 h，經脫蠟、水化、沖洗后，蘇木精染液染色3～5 min，再沖洗、分化、反藍，0.3%伊紅染液染色2～3 min后，沖洗、脫水、二甲苯透明，滴中性樹膠，加蓋玻片封固。光鏡下觀察組織的變化。

1.6免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色取出載玻片先后經脫蠟、水化、組織抗原熱修復后，滴加3% H2O2在室溫下孵育30 min。血清封閉20 min，滴加兔抗人ADAM17抗體(1 ∶150)、兔鼠抗人EGFR抗體(1 ∶150)、兔抗人Ki-67抗體(1 ∶200)4 ℃孵育過夜。第2天滴加生物素標記的二抗工作液，37 ℃靜置30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。在DAB顯色液中避光放置5 min，細胞著色棕黃色為止，再用蘇木精染色2 min，沖水反藍，0.1%鹽酸酒精脫去多余底色后再次脫水,最后滴加中性樹膠，加蓋玻片。用光學顯微鏡下查看染色結果并采集照片。染色結果用Image-Pro-Plus圖像分析軟件進行分析。染色呈棕黃色為陽性，ADAM17和EGFR陽性表達位于細胞胞質，Ki-67蛋白陽性表達位于細胞核內。結果用積分光密度值(integrated optical density,IOD)表示。依據染色指數統計結果，以染色分數(染色強度)評分和陽性細胞率評分評定結果。染色指數(染色分數評分乘以陽性細胞率評分)<3分為陰性；≥3分為陽性。

2 結果

2.1BMSCs的形態結構及生長狀態全骨髓貼壁培養法分離BMSCs，相差顯微鏡下觀察。原代BMSCs可見細胞以梭形及多角形多見，細胞排列混亂，細胞集落較少。第3代BMSCs可見大量貼壁細胞，細胞形態較一致，以長梭形為主，呈集落漩禍狀分布，見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察第3代BMSCs ×40

2.2慢病毒介導的ADAM17-shRNA轉染BMSCs細胞用表達RFP的慢病毒介導將ADAM17-shRNA轉染第3代BMSCs。利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察ADAM17-shRNA的轉染效果。根據BMSCs的紅色熒光判斷轉染率達85%以上，見圖2。慢病毒介導的ADAM17-shRNA成功轉染入BMSCs，且轉染率較高，可以用于后續實驗。

2.3觀察裸小鼠荷瘤的生長情況及抑瘤率30只裸小鼠在皮下種植MCF-7細胞14 d左右，皮下種植部位有腫瘤隆起于皮膚表面，成瘤率達到100%，裸鼠乳腺癌造模成功。治療16 d后觀察各組裸小鼠的瘤體體積大小，肉眼觀察可見轉染組移植瘤體積縮小，抑瘤效果明顯，小鼠精神狀態、進食可，未出現明顯消瘦；而BMSCs組的移植瘤體積與對照組的移植瘤體積無縮小，增長較快，少數腫瘤出現壞死、破潰，小鼠精狀況、進食差，消瘦嚴重，并出現惡病質。測量不同時間段裸小鼠移植瘤的體積變化情況，見表1。實驗結束時，轉染組、BMSCs組、對照組的移植瘤體積分別為(375.09±20.72) 、(765.71±30.31)和(783.95±27.26)mm3，與對照組相比，轉染組腫瘤體積變小，差異有統計學意義(P<0.05)，BMSCs組腫瘤體積變化不大，差異無統計學意義。轉染組、BMSCs組的抑瘤率分別為52.09%、2.35%。

2.4HE染色觀察各組瘤體組織學形態變化HE染色顯示荷瘤裸鼠乳腺癌細胞呈腺體樣排列，細胞呈橢圓形或圓錐形，細胞核位于一側，顯著異型性，呈條索狀分布，可見大量癌細胞形成橢圓形癌巢，浸潤間質，并伴間質出血壞死現象，整體呈人乳腺浸潤性導管癌的典型病理特征，見圖3。與對照組相比，轉染組可見腫瘤組織大片壞死區域、壞死區域細胞崩解，細胞結構消失等，而BMSCs組則無明顯改變。

2.5IHC染色法檢測各組瘤體ADAM17、EGFR和Ki-67的表達

2.5.1轉移瘤ADAM17的表達 ADAM17蛋白定位表達于細胞胞質，陽性反應呈棕黃色染色反應。其中尤以對照組陽性表達最強，BMSCs組與對照組染色大致相同，陽性表達較弱，見圖4。轉染組、BMSCs組與對照組ADAM17蛋白的IOD值分別為(4.91±0.43)、(6.97±0.39)、(7.24±0.52)。與對照組相比較，轉染組ADAM17蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(F=93.970,P<0.05)；而BMSCs組無明顯差異。

圖2 激光共聚焦顯微鏡下觀察ADAM17-shRNA的轉染率

項目腫瘤平均體積18d22d26d30d轉染組119.58±17.19195.05±18.81*266.67±20.15*375.09±20.72*BMSCs組132.50±23.00376.38±23.40545.20±28.51765.71±30.31對照組138.45±17.12402.35±22.79570.37±23.27783.95±27.26F值2.242296.760408.1401075.984P值0.0910.000.000.00

圖3 HE染色觀察各組腫瘤組織的形態結構 ×100

圖4 免疫組織化學染色法檢測各組腫瘤組織ADAM17的表達 ×200

圖5 免疫組織化學染色法檢測各組腫瘤組織EGFR的表達 ×200

2.5.2轉移瘤EGFR的表達 EGFR蛋白定位表達于細胞胞膜和(或)胞質，陽性反應呈棕黃色染色反應，其中尤以對照組陽性表達強，BMSCs組與對照組染色大致相同，陽性表達較強，見圖5。轉染組、BMSCs組與對照組ADAM17蛋白的IOD值分別為(7.86±0.38)、(9.86±0.40)、(10.15±0.53)。與對照組比較，轉染組EGFR蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(F=84.684,P<0.05)；而BMSCs組無明顯差異。

2.5.3轉移瘤Ki-67的表達 Ki-67蛋白定位表達于細胞胞核，陽性反應呈棕黃色染色反應，其中尤以對照組陽性表達強；BMSCs組與對照組染色大致相同，陽性表達較強，見圖6。轉染組、BMSCs組與對照組蛋白的IOD值分別為(8.60±0.64)、(8.37±0.40)、(6.48±0.46)。與對照組相比較，轉染組Ki-67蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(F=58.024,P<0.05)；而BMSCs組無明顯差異。

3 討論

ADAM是近年來新發現的錨定于細胞膜表面，具有多種功能的糖蛋白家族，ADAM家族都包含有相對保守的區域。主要參與神經發育、肌管融合和受精卵形成等過程，ADAM還參與生物活性因子的釋放、細胞融合、細胞基質的降解、細胞-基質的粘連、細胞信號傳導等一系列過程，因此ADAM蛋白家族與腫瘤的形成和發展密切相關。ADAM17屬于ADAM蛋白家族的重要一員，ADAM17一方面能夠發揮蛋白剪切酶樣的作用，從而剪切活化腫瘤壞死因子-α，另一方面還參與多種EGFR配體(雙調蛋白、肝素結合性表皮生長因子、表皮調節素和轉化生長因子α)等的水解釋放過程，ADAM17通過剪切并釋放多種EGFR配體，激活ErbB家族介導的信號級聯傳導系統，影響腫瘤的一系列生物學過程。ADAM17一方面具有剪切、活化細胞膜上腫瘤壞死因子-α的功能，另一方面還具有解聚素和金屬蛋白酶的活性。ADAM17發揮蛋白剪切酶樣作用，從而調節細胞的增殖、遷移運動等多種生物學行為，其在腫瘤發生、發展的整個過程中發揮著十分關鍵的作用。此外，ADAM17還可通過剪切、水解Notch受體，將Notch受體的胞內區轉入胞核區，參與Notch信號傳導通路的激活和轉錄，此信號通路參與腫瘤的增殖、侵襲和轉移等過程[6-9]。EGFR是ErbB家族成員之一，屬于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體。EGFR是存在于細胞膜的跨膜糖蛋白分子，由原癌基因erb B1編碼，erb B1定位于7p11～13，由28個外顯子組成，編碼分子量大小為170 ku。EGFR的胞外配體結合區與相應各種配體相結合后，引起胞外結構域的構象變化，形成異體二聚體結構，進而引起EGFR的磷酸化，以激活下游信號傳導通路(RAS/RAF/MEK/ERK1/2通路、磷脂酶C通路、磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路)，從而調控細胞的分化、增殖和遷移等。EGFR表達異常與多種惡性腫瘤(如結直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、腦膠質瘤、前列腺癌等)的發生密切相關[10-11]。當前研究[12]普遍表明EGFR下游信號通路的激活與ADAM17在惡性腫瘤中的高表達存在著一定的關聯性，并發現ADAM17在前列腺癌和腦膠質瘤細胞中高表達，且ADAM17是通過激活EGFR-PI3K-AKT信號傳導通路，以促進前列腺癌細胞、腦膠質瘤細胞的快速增殖和生長[13]。Ki67是與細胞增殖相關的核抗原，主要位于細胞核內。其抗原表達隨細胞周期的變化而變化, 在G1后期出現，在S、G2期逐漸上升至M期達高峰，有絲分裂結束后迅速降解消失，靜止G0期細胞不表達。該蛋白通過復雜的方式與其他蛋白及DNA和RNA相結合，通過核內結構及空間上的作用，是細胞分裂中核糖體合成的關鍵因子，對細胞增殖必不可少。Ki-67作為常見惡性腫瘤的生物學檢測指標，通過采用IHC等病理學檢查方法[14]，檢測Ki-67的表達情況，以準確判斷其增殖活性，其作為判定惡性腫瘤細胞增殖活性最可靠及最具代表性的一種檢測指標，同時也為評估腫瘤的侵襲能力以及腫瘤患者預后提供了理論指標。

圖6 免疫組織化學染色法檢測各組腫瘤組織Ki-67的表達 ×200

病毒介導轉運載體首先是把病毒基因組中的傳染性和致病性等有害基因剔除后，再把外源的shRNA或外源基因整合到宿主染色體上，包裝成為新的病毒載體，使其具有高效性、連續性地表達目的基因的效果。以慢病毒為載體介導轉運的RNAi技術已被廣泛應用于基礎研究，因慢病毒載體介導轉運對基因表達的沉默具有更好的特異性和更顯著的效果。本研究首先針對目的基因ADAM17設計和合成ADAM17-shRNA慢病毒表達載體，并且設計合成的慢病毒表達載體內部包含RFP的表達框架，轉運入目標靶細胞后可以表達紅色熒光，依據紅色熒光可以判斷靶細胞的轉染效率。在腫瘤的基因靶向治療方面，BMSCs展現了多方面的明顯優勢特點，BMSCs易于分離培養、穩定性強、體外轉染率高、易于外源基因轉染、免疫原性低、排斥反應小、遷移歸巢腫瘤組織能力等，BMSCs以其獨有的特征能夠作為新一代腫瘤生物靶向治療的載體。本課題組前期研究探討轉染ADAM17-shRNA的BMSCs顯著抑制乳腺癌細胞ADAM17的表達，同時也顯著抑制細胞的增殖能力和體外侵襲能力[15]。因此，為進一步深入探討，本研究在動物水平，利用裸小鼠乳腺癌荷瘤模型，將轉染ADAM17-shRNA的BMSCs注射入裸小鼠體內，探討ADAM17-shRNA轉染BMSCs對乳腺癌ADAM17、EGFR和Ki-67基因的影響。本實驗結果顯示轉染組裸小鼠移植瘤體積明顯縮小；HE染色鏡下可見腫瘤組織大片壞死區域，壞死區域細胞崩解，細胞結構消失；并且轉染組的ADAM17、EGFR、Ki67蛋白表達量明顯下降。故可得出結論慢病毒介導ADAM17-shRNA轉染BMSCs，具有抑制裸鼠乳腺癌ADAM17、EGFR和Ki-67的表達，同時發揮裸鼠體內乳腺癌抑瘤效果，為以ADAM17為靶點的乳腺癌靶向治療提供新的方法。

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