抑制軟骨細(xì)胞線粒體自噬增加MMP-1和MMP-13表達(dá)

丁振飛，常 俊，黃 威，曹 樂(lè)，王 濤，饒先亮，尹宗生

骨關(guān)節(jié)炎 (osteoarthritis, OA) 是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性為主要特征的關(guān)節(jié)退行性疾病。OA發(fā)病率、致殘率高，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。OA的軟骨退變機(jī)制復(fù)雜，在軟骨細(xì)胞中線粒體不僅為細(xì)胞產(chǎn)生能量，而且介導(dǎo)其他關(guān)鍵的生物學(xué)行為，它可從細(xì)胞自噬、老化、細(xì)胞死亡等多個(gè)方面影響OA發(fā)生發(fā)展[1-2]。線粒體功能失調(diào)嚴(yán)重影響軟骨細(xì)胞存活，線粒體受損是OA發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]。受損線粒體主要通過(guò)線粒體自噬(mitophagy)降解，因此mitophagy成為保持線粒體的數(shù)量及質(zhì)量穩(wěn)定，維持軟骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及存活重要調(diào)節(jié)機(jī)制[5]。另外mitophagy可降低OA治病因子活性氧 (reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生和炎癥因子的激活[6-7]。但是目前mitophagy在OA病程中的作用機(jī)制尚未明確，所以本研究通過(guò)環(huán)孢素A (cyclosporin A, CsA)抑制軟骨細(xì)胞mitophagy，觀察對(duì)OA相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)表達(dá)的影響，從而深入探討mitophagy在OA中的作用。

1 材料與方法

1.1病例資料所用軟骨來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院在2016年10月～2017年6月接受全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患者，所有患者均符合OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。取術(shù)中截取的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本放入盛有生理鹽水的無(wú)菌盒中，送往實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2主要試劑與藥物Ⅱ型膠原蛋白抗體(英國(guó) Abcam 公司)；鼠源抗 GAPDH 單克隆抗體(美國(guó)Proteintech Group公司)；MMP-1、Tom20抗體(萬(wàn)類生物科技公司)；MMP-13抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)； 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；MMP-1、 MMP-13、GAPDH引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)；Lysotracker (美國(guó)Life Technologies 公司)；Mitotracker、TRIzol 試劑( 美國(guó)Invitrogen公司)；CsA(美國(guó)MedChemExpress公司)；PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1原代軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分組 在超凈工作臺(tái)用手術(shù)刀片將軟骨削成薄片，用含有雙抗的PBS洗3遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小組織粒，移入離心管中離心棄上清液，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶37 ℃恒溫消化0.5 h，離心棄去胰蛋白酶液體 , 加入含血清的培養(yǎng)液中止胰蛋白酶消化；棄上清液，加入2倍體積的0.1 % Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化8～12 h。先以500 r/min離心5 min，此時(shí)消化下來(lái)的細(xì)胞懸浮在上清液中，取上清液，再以1 500 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，剩余軟骨再加入2倍體積的0.1% Ⅱ型膠原酶37 ℃繼續(xù)消化8～12 h，以同樣方法收集細(xì)胞直至所有軟骨全部消化。待貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化，按比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)均使用第二代軟骨細(xì)胞并分為3組:空白對(duì)照組、IL-1β(10 ng/ml)組、IL-1β(10 ng/ml)+ CsA (5 μmol/L)組,待細(xì)胞融合至60%～80%時(shí)給予干預(yù)處理 24 h。

1.3.2軟骨細(xì)胞鑒定 在24孔板中用玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，分別進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫熒光染色。① 甲苯胺藍(lán)染色：傾去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，去除甲醛再以PBS洗3次， 1%甲苯胺藍(lán)染色30 min后PBS洗3次，取出爬片在倒置光鏡下觀察拍照。② Ⅱ型膠原免疫熒光染色：用上述同樣方法固定細(xì)胞，0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS洗3次，滴加正常山羊血清室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，滴加Ⅱ型膠原抗體(1 ∶400)，濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜；37 ℃復(fù)溫30 min，PBS洗3次，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標(biāo)記的二抗(1 ∶100)，濕盒中37 ℃避光孵1 h，PBS洗3次，用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3.3MTR和LTG熒光探針染色 在24孔板中培養(yǎng)各組細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，加入37 ℃預(yù)熱的Mito Tracker Deep Red(100 nmol/L)工作液染色，37 ℃孵育20 min。吸除染液，加入37 ℃預(yù)熱的Lysotracker Green(75 nmol/L)工作液。37 ℃孵育1.5 h，使用PBS替換上述染色液，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4Real-time PCR測(cè)定mRNA的表達(dá) 分別采用TRIzol 法提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)量濃度后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取RT反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)TaKaRa試劑盒說(shuō)明書配20 μl反應(yīng)體系，所用引物序列如下GAPDH：F: 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，R:5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′；MMP-1：F: 5′-AAATAGTGGCCCAGTGGTTG-3′，R:5′- CACATCAGGCACTCCACATC-3′；MMP-13：F: 5′-GACT- TCCCAGGAATTGGTGA-3′，R:5′-TGACGCGAACAA-TACGGTTA-3′，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃引物退火5 s，60 ℃延伸反應(yīng)34 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，離解階段溫度設(shè)置為：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。反應(yīng)終止后根據(jù)所測(cè)Ct值，用2-ΔΔct法計(jì)算出mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 處理細(xì)胞后提取各組細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)4 ∶1混合，經(jīng)水浴鍋煮沸使蛋白變性，將適量各組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，將載有蛋白的PVDF膜移入有一定比例稀釋好一抗的孵育盒中，一抗稀釋比例分別為MMP-13(1 ∶100)、MMP-1(1 ∶500)和Tom20(1 ∶500)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入稀釋好的二抗室溫孵育2 h，配ECL工作液，凝膠成像儀中顯影。

2 結(jié)果

2.1軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果甲苯胺蘭染色：培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)染色后呈紫藍(lán)色，細(xì)胞基質(zhì)呈藍(lán)色，胞內(nèi)及細(xì)胞周圍有藍(lán)紫色異染顆粒，說(shuō)明所培養(yǎng)細(xì)胞可合成蛋白聚糖(圖1A)。Ⅱ 型膠原免疫熒光染色：可見(jiàn)所有細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜呈鮮亮的綠色熒光，細(xì)胞核區(qū)域未見(jiàn)明顯綠色熒光，證明所培養(yǎng)細(xì)胞可合成Ⅱ型膠原蛋白(圖1B-D)。Ⅱ型膠原蛋白與蛋白聚糖是軟骨細(xì)胞標(biāo)志性分泌物，兩種染色均證明本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞均為軟骨細(xì)胞。

圖1 軟骨細(xì)胞鑒定

圖2 免疫熒光共定位檢測(cè)mitophagy的表達(dá) ×400

2.2LTG、MTR雙色熒光探針染色檢測(cè)mitophagyMTR是一種線粒體的紅色熒光探針，用于活細(xì)胞線粒體的特異性熒光染色，LTG是一種自噬體的綠色熒光探針，用于細(xì)胞內(nèi)自噬體的熒光染色，兩者進(jìn)行熒光共定位可以檢測(cè)mitophagy的發(fā)生情況。在熒光顯微鏡下MTR將線粒體標(biāo)記為紅色，LTG將自噬體標(biāo)記為綠色，自噬體與線粒體共定位時(shí)顯現(xiàn)為黃色標(biāo)記。在對(duì)照組幾乎無(wú)明顯的黃色標(biāo)記, IL-1β組可見(jiàn)大量的黃色標(biāo)記，而IL-1β+CsA組只有少量黃色標(biāo)記，見(jiàn)圖2。

2.3各組細(xì)胞MMP-1、MMP-13的mRNA表達(dá)Real-timePCR結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，IL-1β組、IL-1β+CsA組的MMP-1、MMP-13的mRNA表達(dá)量均顯著增高(P<0.01)，與IL-1β組比較，IL-1β+CsA組MMP-1、 MMP-13的mRNA表達(dá)量顯著高于IL-1β組(P<0.01)。各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=715.22，P<0.01；F=617.49，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 MMP-1、MMP-13 mRNA在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)

2.4各組細(xì)胞MMP-1、MMP-13和Tom20蛋白表達(dá)量Western blot結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較，IL-1β組、IL-1β+ CsA組的 MMP-1、MMP-13蛋白表達(dá)量均顯著增高(P<0.05)；與IL-1β組比較，IL-1β+ CsA組MMP-1、MMP-13蛋白表達(dá)量顯著高于IL-1β組(P<0.05)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.48，P<0.01；F=16.45，P<0.01)；同時(shí)與空白對(duì)照組比較，IL-1β組Tom20蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；而與IL-1β組比較，IL-1β+ CsA組Tom20蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 MMP-1、MMP-13和Tom20蛋白在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

OA的發(fā)病機(jī)制并未完全明確，可能與生物力學(xué)改變、軟骨細(xì)胞老化、細(xì)胞內(nèi)自由基、金屬蛋白酶降解等相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶在OA的滑膜、 軟骨組織均可產(chǎn)生，可降解軟骨基質(zhì)致軟骨破壞，也是眾多細(xì)胞因子作用的重要環(huán)節(jié)。其中MMP-1在正常軟骨中則很少表達(dá)，而在OA軟骨中的表達(dá)明顯升高。MMP-1可作用于Gly906-Leu907的肽鍵，從而裂解軟骨基質(zhì)的主要成分Ⅱ型膠原蛋白，從而促進(jìn)OA軟骨的退變。與MMP-1同屬于膠原酶的MMP-13不僅可與MMP-1作用相同的位點(diǎn)裂解Ⅱ型膠原蛋白，而且可對(duì)裂解之后的Ⅱ型膠原小片段進(jìn)行二次裂解。在眾多基質(zhì)金屬蛋白酶亞型中，MMP-13是最有效的Ⅱ型膠原降解酶，其降解速率可達(dá)到MMP-1的十倍之多，與OA相關(guān)性較高[9]。在眾多促炎因子中，IL-1β在啟動(dòng)和促進(jìn)OA進(jìn)展中具有重要作用。IL-1β不僅可通過(guò)上調(diào)可誘導(dǎo)一氧化氮合酶與環(huán)氧化酶2進(jìn)而促進(jìn)一氧化氮、前列腺素E2 的分泌[10]，而且可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶分泌參與OA發(fā)生發(fā)展。在本研究中，采用IL-1β刺激OA軟骨細(xì)胞MMP-1、MMP-13表達(dá)增多，這與Santangeol et al[11]干預(yù)結(jié)果相一致。

OA病理上可累及整個(gè)關(guān)節(jié)內(nèi)所有組織，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞則處在一個(gè)低氧、炎癥刺激的微環(huán)境中，炎癥的激活和低氧均可損傷線粒體，受損線粒體主要通過(guò)特異性的標(biāo)記蛋白遷移并形成自噬體，最終與溶酶體融合降解，這個(gè)過(guò)程稱為mitophagy[5,12]。mitophagy機(jī)制并未完全明確，但是研究[13-14]表明受損的線粒體可通過(guò)線粒體通透性轉(zhuǎn)換使線粒體去極化，從而與自噬體融合發(fā)生mitophagy。CsA能與位于線粒體基質(zhì)空間中親環(huán)蛋白D結(jié)合從而特異性的抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換從而減少mitophagy的發(fā)生。Tom20為線粒體外膜蛋白受體，定位于線粒體上穩(wěn)定表達(dá)，當(dāng)mitophagy發(fā)生增多時(shí)表達(dá)降低。本研究結(jié)果顯示當(dāng)OA軟骨細(xì)胞受IL-1β刺激之后，LTG、MTR熒光染色共定位明顯增多，Tom20蛋白減少，說(shuō)明軟骨細(xì)胞內(nèi)mitophagy發(fā)生增加。在正常狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)性mitophagy水平很低，起到了維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用，但在IL-1β刺激下，線粒體受損增多，mitophagy會(huì)增強(qiáng)以清除受損線粒體保護(hù)細(xì)胞免受損傷。而當(dāng)加有mitophagy抑制劑CsA后，LTG、MTR熒光染色共定位相對(duì)IL-1β組減少，Tom20蛋白也相對(duì)增加，說(shuō)明mitophagy被抑制，但MMP-1、MMP-13表達(dá)進(jìn)一步增多，提示抑制OA軟骨細(xì)胞mitophagy可使MMP-1、MMP-13表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)OA的發(fā)展。

受損的線粒體可介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，mitophagy通過(guò)清除受損的線粒體使其選擇性的隔離和降解，防止進(jìn)一步的損傷，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，mitophagy功能障礙與多種老齡化病變相關(guān)[15]。因此，筆者推測(cè)抑制mitophagy的發(fā)生使受損的線粒體無(wú)法有效的清除，致使受損線粒體堆積并繼續(xù)產(chǎn)生大量活性氧、炎癥因子激活、細(xì)胞色素C等對(duì)軟骨細(xì)胞有害的物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)MMP-1和MMP-13表達(dá)。本研究初步揭示軟骨細(xì)胞中mitophagy的抑制可增加OA相關(guān)蛋白MMP-1和MMP-13表達(dá)，說(shuō)明mitophagy在OA進(jìn)展中有一定保護(hù)作用，但具體分子機(jī)制及作用途徑并不明了，而且本研究為體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)于復(fù)雜多變的體內(nèi)環(huán)境有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)

[1] Wu L, Liu H, Li L, et al. Mitochondrial pathology in osteoarthritic chondrocytes[J]. Curr Drug Targets，2014，15(7):710-9.

[2] Blanco F J, Rego I, Ruiz-Romero C. The role of mitochondria in osteoarthritis[J]. Nat Rev Rheumatol, 2011, 7(3): 161-9.

[3] Roach H I. The complex pathology of osteoarthritis: even mitochondria are involved[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(8): 2217-8.

[4] Blanco F J, Lopez-Armada M J, Maneiro E. Mitochondrial dysfunction in osteoarthritis[J]. Mitochondrion, 2004, 4(5-6): 715-28.

[5] Twig G, Hyde B, Shirihai O S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view[J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1777(9): 1092-7.

[6] Zhong Z, Umemura A, Sanchez-Lopez E, et al. NF-kappaB restricts inflammasome activation viaelimination of damaged mitochondria[J]. Cell, 2016, 164(5): 896-910.

[7] Bin-Umer M A, Mclaughlin J E, Butterly M S, et al. Elimination of damaged mitochondria through mitophagy reduces mitochondrial oxidative stress and increases tolerance to trichothecenes[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(32):11798-803.

[8] 邱貴興. 骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)[J]. 中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版),2007, 1(4): 281-5.

[9] Mitchell P G, Magna H A, Reeves L M, et al. Cloning, expression, and type II collagenolytic activity of matrix metalloproteinase-13 from human osteoarthritic cartilage[J]. J Clin Invest, 1996, 97(3): 761-8.

[10] El Mansouri F E, Chabane N, Zayed N, et al. Contribution of H3K4 methylation by SET-1A to interleukin-1-induced cyclooxygenase 2 and inducible nitric oxide synthase expression in human osteoarthritis chondrocytes[J]. Arthritis Rheum, 2011, 63(1): 168-79.

[11] Santangelo K S, Nuovo G J, Bertone A L.Invivoreduction or blockade of interleukin-1beta in primary osteoarthritis influences expression of mediators implicated in pathogenesis[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2012, 20(12): 1610-8.

[12] Kim I, Rodriguez-Enriquez S, Lemasters J J. Selective degradation of mitochondria by mitophagy[J]. Arch. Biochem Biophys, 2007, 462(2): 245-53.

[13] Rodriguezenriquez S, Kim I, Currin R T, et al. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes[J]. Autophagy, 2006, 2(1): 39-46.

[14] Elmore S P, Qian T S, Lemasters J J. The mitochondrial permeability transition initiates autophagy in rat hepatocytes[J]. FASEB J, 2001, 15(12): 2286-7.

[15] Green D R, Galluzzi L, Kroemer G. Mitochondria and the autophagy-inflammation-cell death axis in organismal aging[J]. Science, 2011, 333(6046): 1109-12.