FAM96A在人肝癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

廖宇圣，張 姮，黃曼玲，田 俊

96序列相似的家庭成員A (family with sequence similarity 96, member A, FAM96A) 是普遍存在、高度保守、與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic peptidase activating factor 1，APAF1)相互作用的促腫瘤細胞凋亡的抑癌基因，功能未知[1]。關于FAM96A 在肝癌發生發展中功能未見報道。因此，本研究旨在通過檢測肝癌組織和細胞中FAM96A表達, 并統計分析FAM96A在肝癌組織和配對癌旁組織中的表達差異與肝癌臨床病理特征及預后的關系，初步探討FAM96A在肝癌中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1病例資料在通過華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院醫學倫理委員會批準并獲得患者本人及家屬同意的情況下，本次研究選擇本院2015年1月～2016年12月收治的48例肝癌患者為研究對象。肝癌組織標本和距腫瘤邊緣>2 cm處癌旁組織標本均置于-80 ℃ 保存備用。

1.2主要試劑FAM96A、β-actin一抗及二抗均購自英國Abcam公司；RNA提取、逆轉錄及SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；總蛋白抽提試劑盒、電化學發光試劑盒均購自美國Invitrogen公司；細胞培養基、胎牛血清、胰酶均購自日本Sigma公司。

1.3Real-timePCR法檢測FAM96AmRNA表達提取組織標本和細胞中的總mRNA，取4 μg mRNA按照逆轉錄試劑盒的使用說明合成cDNA，逆轉錄獲取的cDNA置-20℃ 保存備用，其余RNA置-80℃ 保存備用。Real-time PCR總反應體系20 μl：SYBR Green 10 μl，上下游引物濃各0.6 μl(濃度均為10 μmol/L)，cDNA 2 μl，DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水補齊至20 μl。反應條件為變性、退火及延伸，設定35個循環。本實驗中，肝癌組織和細胞所用FAM96A 和β-actin引物、Real-time PCR總反應體系和設定的反應條件均相同，由Real-time PCR儀自動生成數據。引物序列如下。FAM96A F：5′-GCAAAGCACGCTGGAACT-3′，R：5′-GGCCGAGACAAGCCTAAA-3′；β-actin F：5′-TGAGA CCTTCAACACCCCAG-3′，R：5′-GCCATCTCTTGCTC GAAGTC-3′。

1.4Westernblot法檢測FAM96A蛋白表達分別稱取0.08 g肝癌組織和癌旁組織、待細胞生長至80%～90%匯片時收集細胞，提取蛋白并定量。各組取120 μg蛋白樣品上樣于濃度為5%的濃縮膠和15%的分離膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳條件設定為：濃縮膠80 V，分離膠100 V。PVDF膜轉移蛋白， 封閉一抗，標記二抗，電化學發光法顯影。

2 結果

2.1FAM96A在組織中的表達Real-time PCR檢測結果顯示，FAM96A在肝癌組織中的mRNA表達低于癌旁組織(0.447±0.117vs1.526±0.323,t=21.773,P<0.001)。Western blot 檢測結果顯示：與癌旁組織比較，FAM96A在肝癌組織中的蛋白表達顯著降低(0.701±0.207vs1.452±0.262,t=15.582,P<0.001)，見圖2。

2.2FAM96A在細胞中的表達與L02細胞相比，FAM96A在HepG2細胞中mRNA表達顯著降低 (0.500±0.111vs1.654±0.285,t=26.153,P<0.001)， FAM96A在HepG2細胞中蛋白表達同樣降低(0.612±0.245vs1.375±0.271,t=14.478,P<0.001)。

2.3FAM96A蛋白表達水平與肝癌臨床病理特征之間的關系FAM96A蛋白表達差異與本研究中48例肝癌患者腫瘤大小、是否合并門靜脈癌栓、是否發生肝外轉移、Child分級、巴塞羅那肝癌分期(Barcelona clinical liver cancer staging system, BCLC)之間差異有統計學意義(P<0.001)，然而與患者的性別、年齡、腫瘤個數、是否合并乙肝、是否合并肝硬化、血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)無明顯相關性(P>0.05)。見表1。

圖1 肝癌組織及癌旁組織中FAM96A的mRNA和蛋白表達

圖2 HepG2細胞和L02細胞中FAM96A的mRNA和蛋白表達

臨床病理特征例數表達量t值P值性別 男340.617±0.2340.3230.748 女140.591±0.287年齡(歲) ≤50300.613±0.2430.0350.972 >50180.610±0.256腫瘤大小(cm) ≤5180.853±0.1818.1900.000 >5300.467±0.143腫瘤數目 單發310.605±0.211-0.8790.384 多發170.614±0.316乙肝 陽性410.618±0.2530.4020.689 陰性70.577±0.201肝硬化 有380.605±0.240-0.4610.647 無100.645±0.275血清AFP(ng/ml) ≤20150.681±0.2331.3200.193 >20330.581±0.247門靜脈癌栓 有130.328±0.070-6.9340.000 無350.717±0.197肝外轉移 陽性80.281±0.034-5.2250.000 陰性400.678±0.212Child分級 A390.686±0.2085.6550.000 B90.289±0.040BCLC分期 A280.772±0.1828.5290.000 B+C200.388±0.101

3 討論

原發性肝細胞性肝癌(primary carcinoma, HCC)簡稱肝癌，是惡性程度極高、預后極差的較為常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康與生命財產安全[2]。最新流行病學資料顯示，我國肝癌的發病率位列世界第一，死亡率在癌癥相關死因中排列第四，5年生存率僅為10%，復發和轉移是導致生存率低的主要原因。一般認為肝癌的發生與乙型肝炎病毒感染和黃曲霉毒素攝入有關, 但機制不明[3-4]。因此，深入研究肝癌發生機制對于肝癌預后具有重大臨床意義。

研究表明HCC的發生發展是包括病毒或化學物質的作用導致癌基因激活和/或抑癌基因失活在內的多階段多步驟過程[5]。FAM96A與FAM96B屬于同源蛋白，均通過相互作用蛋白發揮功能，具體機制不明確。目前國內外對FAM96B的功能研究已取得突破性定進展, 研究結果證實FAM96B與甲基磺酸敏感性基因19、著色性干皮病基因D組成蛋白復合物發揮功能。在人肝癌、結腸癌組織中低表達，參與腫瘤的發生發展，定位于紡錘體，在有絲分裂染色體正常分離中發揮關鍵作用，FAM96B基因沉默可導致腫瘤細胞不能正常有絲分裂，異型細胞核堆積，細胞凋亡，是癌癥潛在的診斷和治療靶點[6-9]。但國內外關于FAM96A的研究報道卻很少，最新研究[1]表明，FAM96A與CIA2A組成蛋白復合物CIA2A-FAM96A維持細胞鐵穩態。目前未見FAM96A在人肝癌中的功能研究報道。因此，本研究旨在探索FAM96A在肝癌組織中的表達差異及臨床意義，以期為肝癌診斷和治療提供新的靶點和思路。

分析基因與腫瘤關系的基礎是觀察腫瘤組織及配對癌旁正常組織的差異性表達，異常表達的基因被認為是潛在的新的調控細胞增殖與凋亡的癌基因和/或抑癌基因，極有可能在腫瘤的惡性進展中扮演重要角色[10]。本研究團隊分別采用Real-time PCR和Western blot技術檢測FAM96A在基因和蛋白水平的表達差異。檢測結果表明：與癌旁組織比較，FAM96A在肝癌組織中的蛋白和mRNA表達均顯著降低，同時，與人正常胎肝細胞系L02相比，FAM96A在人肝癌細胞系HepG2中的蛋白和mRNA表達均明顯降低。本研究分別從人體組織標本及人肝癌細胞系兩方面證實FAM96A在肝癌發生發展中發揮一定作用。FAM96A可能是一種潛在抑癌基因直接或間接抑制肝癌和其他腫瘤的發生發展。Zhang et al[11]通過建立H22荷瘤裸鼠模型探索外源性FAM96A在動物體內對腫瘤的作用，研究結果證實FAM96A抑制裸鼠腫瘤生長、促進腫瘤細胞凋亡、降低死亡率。Schwamb et al[12]報道FAM96A與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic peptidase activating factor 1，APAF1)相互作用，通過線粒體凋亡途徑對間質瘤發揮促凋亡作用。過表達FAM96A可促進間質瘤細胞系GIST882凋亡，并在體內和體外抑制間質瘤生長。FAM96A低表達或基因沉默將導致間質瘤的發生。本研究結果與國外文獻報道基本一致。

筆者通過統計分析FAM96A蛋白表達差異與肝癌臨床病理特征之間的相關性得出：FAM96A蛋白在肝癌組織與癌旁組織中的蛋白表達差異與48例肝癌患者的性別、年齡、腫瘤個數、是否合并乙肝、肝硬化、AFP無明顯相關。目前，肝癌篩查、早期診斷、預后評價較為實用的診斷方法是血清AFP檢測。但并非所有肝癌細胞都分泌AFP，且部分患者AFP值并不升高。因此AFP用來診斷肝癌容易造成漏診[13]。本研究結果中FAM96A在肝癌組織中的表達與AFP無關，即FAM96A有可能成為不依賴AFP的肝癌標記物。腫瘤細胞與正常細胞區別的重要生物學特征是腫瘤細胞會無限侵襲和轉移，腫瘤細胞脫離原發灶，侵犯周圍組織、血管及淋巴管，進入循環系統并向遠處組織侵襲擴散形成新的轉移灶，轉移灶在血供充分的情況下即增殖形成轉移瘤[14-15]。本研究結果顯示FAM96A在肝癌組織中低表達與與腫瘤大小、門靜脈癌栓、遠處轉移、Child分級、BCLC分期密切相關。本研究結果有力地證實FAM96A可能是一個與肝癌惡性進展相關的分子生物學標志物，極有可能在肝癌惡性進展中起到直接或間接的抑制作用。

綜上所述，筆者從新鮮肝癌組織標本、肝癌細胞株等方面對FAM96A的功能進行研究，發現FAM96A可能是一種新的抑癌基因，在肝癌惡性進展中發揮關鍵作用。提示FAM96A可能成為一個新的肝癌生物學標志物，為尋找肝癌基因靶點提供有利證據。本研究雖然對FAM96A在肝癌發生發展中的功能研究取得了初步進展，但仍有許多未知領域需要科研工作者不斷探索，如：FAM96A在除肝癌外的其他腫瘤組織中的表達差異，FAM96A過表達或基因沉默對腫瘤細胞增殖凋亡和侵襲轉移等生物學功能、細胞有絲分裂的影響及機制，外源性FAM96A對裸鼠移植瘤生長抑制、凋亡和轉移的影響等。相信隨著不斷探索與創新，FAM96A的細胞生物學功能研究將得到突破性進展，FAM96A抑制腫瘤細胞惡性進展的作用將被裸鼠移植瘤模型的體內實驗所證實，為進一步的臨床應用提供可靠數據。

參考文獻

[1] Stehling O, Mascarenhas J, Vashisht A A, et al. Human CIA2A-FAM96A and CIA2B-FAM96B integrate iron homeostasis and maturation of different subsets of cytosolic-nuclear iron-sulfur proteins[J]. Cell Metal, 2013, 18(2):187-98.

[2] 中國抗癌協會肝癌專業委員會，中國抗癌協會臨床腫瘤學協作專業委員會，中華醫學會肝病學分會肝癌學組. 原發性肝癌規范化診治的專家共識[J].中華肝臟病雜志，2009，17(6)：403-10.

[3] Jemal A, Bray F, Center M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

[4] Altekruse S F, McGlynn K A, Reichman M E. Hepatocellular carcinoma incidence, mortality, and survival trends in the United States from 1975 to 2005[J]. J Clin Oncol, 2009, 27(9):1485-91.

[5] Sakai T, Sowa Y. Molecular-tatgeting therapies against quantitative abnormalities in gene expression with malignant tumors[J]. Cancer Sci, 2017, 108(4):570-3.

[6] Ito S, Tan L J, Andoh D, et al. MMXD, a TFIIH-independent XPD-MMS19 protein complex involved in chromosome segregation[J]. Mol Cell, 2010, 39(4):632-40.

[7] Yang W, Itoh F, Ohya H, et al. Interference of E2-2-mediated effect in endothelial cells by FAM96B through its limited expression of E2-2[J]. Cancer Sci, 2011, 102(10):1808-14.

[8] 張智勇，蔡 遜，馬丹丹，等. 96序列相似的家庭成員B在肝癌中的表達變化及功能研究[J]. 中華實驗外科雜志，2014, 31(7)：1489-91.

[9] 蔡 遜，馬丹丹，田 俊，等. FAM96B基因在結腸癌組織中低表達且抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡[J]. 華中科技大學學報(醫學版)，2016，45(2)：132-5.

[10] Si M L, Zhu S, Wu H, et al. MiR-21 mediated tumor growth[J]. Oncogene, 2007, 26(19):2799-803.

[11] Zhang M Y, Wang J P. A multi-target protein of hTERTR-FAM96A presents significant anticancer potent in the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Tumor Biol, 2017, 39(4):1-10.

[12] Schwamb B, Pick R, Fernandez S B, et al. FAM96A is a novel pro-apoptotic tumor suppressor in gastrointestinal stromal tumors[J]. Int J Cancer, 2015, 137(6):1318-29.

[13] Braillon A. Is the American Association for the Study of Liver Diseases recommendation for hepatocellular carcinoma screening a cul-de-sac?[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(21):3369-70.

[14] Fidler I J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3(6):453-8.

[15] Kitamura T, Taketo M M. Keeping out the bad guys: gateway to cellular target therapy[J]. Cancer Res, 2007, 67(21):10099-102.