中藥復方糖腎安對實驗性2型糖尿病大鼠腎組織Nrf2/ARE通路的影響

王 璐，張殿鴻，王 鎂

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032)

糖尿病性腎臟疾病(DKD)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一,已成為終末期腎病的重要原因[1]。DKD的發生與氧化應激及炎癥反應密切相關。核因子NF-E2相關因子(Nrf2)通過與抗氧化反應元件(ARE)相互作用調節編碼抗氧化蛋白，是內源性抗氧化應激最重要的通路[2]。而Nrf2與ARE上的GCTGAGTCA結合，啟動Nrf2一系列下游的抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶表達，如血紅素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)等[3]。研究表明核因子κB(NF-κB)是眾多炎癥因子的轉錄調節蛋白，NF-κB信號激活可以直接在轉錄水平抑制Nrf2/ARE信號通路介導的基因轉錄表達，從而導致Nrf2無法激活[4]。復方糖腎安是王鎂教授以“補益脾腎”為基礎理論，在實踐中不斷優化而創立的中藥方劑。前期實驗研究已證明，糖腎安對腎臟的保護作用與抗氧化應激反應有關[5]。本研究進一步探討了糖腎安的腎臟保護作用與Nrf2/ARE通路的關系，現將結果報道如下。

1 實驗資料

1.1實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠50只，體質量230～300 g，動物合格證編號:SCSK(遼)2010-0001，購于沈陽龍云經濟動物養殖場，飼養于遼寧中醫藥大學實驗中心。

1.2主要實驗試劑及藥品 糖腎安煎劑(由白術、茯苓、黃芪等中藥組成)中的藥材購于遼寧中醫藥大學附屬醫院；蛋白裂解液(碧云天生物技術公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；厄貝沙坦(購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，生產批號：2A292)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)；Nrf2抗體、HO-1抗體、NF-κB抗體(購自武漢博士德公司)。

1.3主要儀器設備 EQ.0603-021型PCR儀(購自日本Ta KaRa公司)，Bioshine GelX 1520 型凝膠成像系統(購自美國UVP公司)，血糖儀及血糖試紙(購自德國拜耳公司安康系列)。

1.4實驗方法

1.4.1模型制作 50只健康雄性SD大鼠普通飼料適應性喂養1周，隨機分為正常組8只和造模組42只。參照文獻[6-8]方法，造模組大鼠給予高糖高脂飼料(普通飼料67%、蔗糖20%、膽酸鹽1%、膽固醇2%、豬油10%)喂養4周，然后禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射1% STZ 35 mg/kg，注射72 h后，尾靜脈采血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L且有多飲、多食、多尿的癥狀提示2型糖尿病大鼠造模成功(3只大鼠未成模，予以剔除)。正常組注射相應量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.4.2動物分組及給藥 將成模大鼠隨機分為模型組7只，糖腎安低、中、高劑量組及西藥組各8只。糖腎安低、中、高劑量組分別給予糖腎安6，18，60 g/(kg·d)灌胃，西藥組給予厄貝沙坦13.5 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組每天給予相應量的生理鹽水灌胃，均1次/d，連續灌胃8周。實驗過程中糖腎安低劑量組2只死亡，從實驗中剔除。

1.4.3樣本采集 各組大鼠末次灌胃1 h后稱體質量，取10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內注射麻醉，腹腔暴露，游離腎臟，去除被膜，濾紙吸干血跡，切取左側腎臟，部分腎組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定，4 ℃冷藏保存，留做免疫組織化學觀察；切取右側腎臟，一分為二，部分置于凍存管中，用于Western blot檢測，部分置于1 mL Trizol溶液中用于RT-PCR檢測，置于-80 ℃冷凍保存。

1.5觀察指標

1.5.1大鼠腎組織中Nrf2、HO-1蛋白檢測 采用免疫組化SP法檢測。每組各取5只大鼠標本，常規處理石蠟切片，滅活內源性過氧化酶，高壓煮沸法進行抗原修復，血清封閉后依次加入相應的一抗、二抗。DAB顯色，蘇木精復染。

1.5.2大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白檢測 采用Western blot技術檢測。每組各取6只大鼠腎皮質組織約100 mg，加入細胞裂解緩沖液，在玻璃研磨器中研磨，冰浴1 h，BCA法測定上清液蛋白濃度。各組取50 μg組織裂解蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，電轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，TBST洗膜，分別加入一抗NF-κBp65置于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，各組加入二抗后置于37 ℃孵育2 h；以上兩步后TBST洗膜10 min×3次；用ECL發光法檢測各組NF-κBp65蛋白表達情況，以GAPDH為內參，用凝膠圖像處理系統分析。Image J分析系統軟件對Western條帶進行定量分析，確定條帶的吸光度值。

1.5.3大鼠腎組織中NF-κBp65 mRNA檢測 采用RT-PCR技術檢測。每組各取6只大鼠腎組織，采用Trizol沉淀法提取腎組織總RNA，操作按照逆轉錄試劑盒的說明書進行；將所得樣品cDNA用于Real-Time PCR反應；同時將GAPDH作為內在參照基因；將PCR產物進行測序并做熔解曲線，以保證以上PCR反應產物良好的特異性，計算△Ct值用來比較給藥前后mRNA的表達變化。

1.5.4大鼠腎組織中SOD活性檢測 取各組大鼠腎組織，制成10%均漿，采用ELISA法檢測腎組織中SOD活性，操作順序嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1各組大鼠腎組織中Nrf2、HO-1表達水平比較 模型組及各給藥組Nrf2、HO-1表達水平均顯著高于正常組(P均<0.05)；糖腎安中、高劑量組及西藥組Nrf2、HO-1表達水平均顯著高于模型組(P均<0.05 )；糖腎安低劑量組Nrf2、HO-1表達水平均顯著低于西藥組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組HO-1表達水平顯著高于西藥組(P<0.05)。見表1及圖1～12。

表1 各組大鼠腎組織中 Nrf2、HO-1表達水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與正常組比較，P<0.01；③與模型組比較，P<0.05；④與模型組比較，P<0.01；⑤與西藥組比較，P<0.05；⑥與西藥組比較，P<0.01。

2.2各組大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白和mRNA表達情況比較 模型組NF-κBp65蛋白和mRNA表達水平均顯著高于正常組(P均<0.05)，各給藥組NF-κBp65蛋白表達水平和糖腎安低中劑量組及西藥組NF-κBp65 mRNA表達水平均顯著高于正常組(P均<0.05)；各給藥組NF-κBp65蛋白和mRNA表達水平均顯著低于模型組(P均<0.05)；糖腎安低劑量組NF-κBp65蛋白mRNA表達水平均顯著高于西藥組(P均<0.05)。見圖13、圖14及表2。

圖1 正常組大鼠腎組織中Nrf2表達情況

圖2 模型組大鼠腎組織中Nrf2表達情況

圖3 糖腎安低劑量組大鼠腎組織中Nrf2表達情況

圖4 糖腎安中劑量組大鼠腎組織中Nrf2表達情況

圖5 糖腎安高劑量組大鼠腎組織中Nrf2表達情況

圖6 西藥組大鼠腎組織中Nrf2表達情況

圖7 正常組大鼠腎組織中HO-1表達情況

圖8 模型組大鼠腎組織中HO-1表達情況

圖9 糖腎安低劑量組大鼠腎組織中HO-1表達情況

圖10 糖腎安中劑量組大鼠腎組織中HO-1表達情況

圖11 糖腎安高劑量組大鼠腎組織中HO-1表達情況

圖12 西藥組大鼠腎組織中HO-1表達情況

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組圖13 各組大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白表達情況

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組圖14 各組大鼠腎組織中NF-κBp65 mRNA表達情況

2.3各組大鼠腎組織中SOD活性比較 正常組、模型組、糖腎安低劑量組、糖腎安中劑量組、糖腎安高劑量組及西藥組大鼠腎組織中SOD活性分別為(148.82±7.50)IU/mL、(22.37±10.15)IU/mL、(43.66±18.73)IU/mL、(81.87±15.41)IU/mL、(96.09±11.91)IU/mL、(96.57±10.93)IU/mL，模型組及各給藥組SOD活性均顯著低于正常組(P均<0.05)，各給藥組SOD活性均顯著高于模型組(P均<0.05)，糖腎安低、中劑量組SOD活性均顯著低于西藥組及糖腎安高劑量組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組及西藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白和mRNA表達情況

注：①與正常組比較，P<0.01；②與正常組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05；④與模型組比較，P<0.01；⑤與西藥組比較，P<0.05；⑥與西藥組比較，P<0.01。

3 討 論

DKD的發生發展不僅與蛋白非酶糖化、糖脂代謝紊亂、血流動力學、遺傳背景有關，還與氧化應激、炎癥反應密切相關。ARE是細胞保護蛋白基因表達和Ⅱ相解毒酶的上游調節區，這一序列的激活因子是Nrf2。活化的Nrf2從Keap1解離后進入細胞核，與細胞核內Maf蛋白結合成異二聚體后與ARE序列結合，進而啟動ARE所調控基因的轉錄，稱為Keap1-Nrf2-ARE通路，該通路是一種重要的抗氧化應激通路[9]。高糖狀態下產生過多的活性氧(ROS)，消耗了通過機體自身Nrf2/ARE通路激活所增加的HO-1等抗氧化蛋白，使機體抗氧化應激能力減弱，激活內源性抗氧化應激Nrf2/ARE信號通路，減輕腎臟的氧化應激反應，從而發揮對機體腎臟的保護作用，可延緩糖尿病的發展，預防糖尿病并發癥的發生，改善代謝紊亂，減輕糖尿病引起的腎損害[10-12]。張鎳等[13]研究結果顯示積雪草酸可激活糖尿病大鼠腎臟Nrf2-ARE信號通路，增強機體抗氧化蛋白HO-1的表達，提高腎臟的抗氧化應激能力，從而延緩DKD的進展。

糖尿病狀態下腎素-血管緊張素系統(RAS)活性增高,尤其是腎組織中AngⅡ含量增加,可促進ROS的合成,ROS激活絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號傳導通路,核因子抑制蛋白(IκB)磷酸化而被降解,使IκB與NF-κB分離,激活NF-κB的表達[14]。NF-κB是重要的炎癥遞質轉錄調節因子，而Nrf2是細胞防御多種氧化應激損傷的核心轉錄調節因子，具有抗氧化損傷及抗炎等作用，并能抑制NF-κB活性[15]。陳凱等[16]觀察經血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦干預后，糖尿病大鼠腎臟組織內質網膜蛋白NK-κB蛋白表達明顯下調，表明纈沙坦能夠激活 NF-κB系統，抑制炎癥反應，從而保護糖尿病大鼠腎臟組織。本實驗結果顯示，模型組大鼠腎組織中NF-κBp65表達水平顯著高于正常組，提示激活了糖尿病大鼠腎組織中炎癥反應，與此同時，Nrf2、HO-1在核蛋白中的表達增高，推測糖尿病大鼠腎組織的炎癥反應與氧化應激引起了機體保護性應激反應，刺激Nrf2的活化引起其下游靶基因HO-1上升；給予糖腎安干預后，各組大鼠腎組織中Nrf2及HO-1水平繼續上調，NF-κBp65水平降低，活化受到抑制，并呈濃度梯度依賴，提示在糖腎安干預下，Nrf2活性激活，調控HO-1表達升高，進一步啟動機體抗炎、抗氧化反應，抑制NF-κBp65表達，減輕糖尿病大鼠腎組織炎性及氧化應激反應，從而發揮保護腎臟作用。

綜上所述，中藥復方糖腎安治療糖尿病腎病的機制與激活內源性抗氧化應激通路Nrf2/ARE，提高Nrf2及其下游因子HO-1的活性，抑制NF-κBp65的表達，減輕腎臟炎癥水平，從而發揮抗氧化作用有關。

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