放牧及AM真菌對垂穗披堿草生長和白粉病抗性的影響

郭艷娥，張 峰，李 芳，段廷玉(蘭州大學 草地農業生態系統國家重點實驗室/農業部草牧業創新重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000)

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizae, AM)真菌，作為土壤微生物的重要組成部分，在草地農業生態系統中廣泛存在，可與80%以上陸生維管植物根系建立共生關系[1]。菌根共生體的形成能夠改善宿主植物的營養狀況，促進其對土壤中N、P 等礦質元素的吸收[2]，提高植物的生物量[1]。此外，AM真菌作為生防因子，表面大量延伸著由根內與根外菌絲組成的龐大菌絲網，構成對病原菌的機械屏障[3-5]，能夠有效控制病害的發生。當植物受到病原菌侵染時，其正常的生長代謝功能受到影響，而這些不利影響所造成的損失可通過建成完善的AM共生體得到部分補償[6]。Cordier等[7]采用分根法首次證實AM共生體的形成可誘導寄主產生系統抗性。菌根化番茄(Lycopersiconeseulentum)在受到寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)攻擊產生抗性反應時，被AM真菌侵染的根系細胞對病原菌表現出明顯的抗性，而非菌根化處理并未觀察到類似反應。放牧是天然草地的主要利用方式，在放牧條件下，家畜的采食、踐踏和排泄等行為會對植物的生長、多樣性及土壤的理化性質等產生影響，而這些又是影響AM真菌的直接因素，因此放牧勢必會影響AM真菌的生長和多樣性[8-9]，進而影響牧草的養分吸收和生長發育效應。如Su等[10]對不同放牧強度下AM真菌的研究中發現，AM真菌的孢子密度、侵染率和種類等，隨放牧強度增加顯著降低。曹路等[11]認為放牧強度能影響AM真菌泡囊結構，輕度和中度放牧可促進AM真菌泡囊的形成，重度放牧則顯著抑制。李芳等[12]的研究發現AM真菌侵染率隨著放牧強度的增加而增加，以重度放牧最高，中度放牧次之，輕度放牧最低。然而Lugo等[13]的調查顯示放牧并未影響阿根廷天然草地的AM真菌侵染率。放牧對AM真菌的影響與土壤養分狀況密切有關，養分含量過高或過低都會降低菌根的侵染率及其在土壤中的侵染數量。在一定范圍內AM真菌的數量隨有機質含量的升高而增加，但當超過這個范圍時，數量下降[14]。此外，放牧對AM真菌的影響因AM真菌種類不同而異，如地表球囊霉(Glomusversiforme)和根內球囊霉(Rhizophagusintraradices)對長期過度放牧反應敏感，但另外一些種，如摩西球囊霉(G.mosseae)，則不被影響[10]。因此，開展放牧對AM真菌的研究，可為利用放牧防控草地病害提供理論依據。

病害已成為限制草牧業生產的主要因素之一，可降低牧草產量和品質，使家畜生產力減弱，影響草地生態系統的持續性和穩定性，并造成重大經濟損失[15-17]。劉日出[18]對甘南藏族自治州內不同圍封年限天然草地的調查共發現11科16屬19種植物的27種病害，主要是銹病和葉斑類病害。張蓉[19]對該地的11個科包括30個屬的植物病原菌調查后，共鑒定出黑粉病2科4屬11種，占鑒定總數的25%；銹病1科11屬11種，占鑒定總數的25%；麥角病1科3屬3種，占鑒定病害總數的6.82%；白銹病1科1屬和2種，占鑒定總數的4.55%；白粉病1科5屬5種，占鑒定總數的11.36%；霜霉病1科3屬3種，占鑒定總數的6.82%；葉斑類病害9種，占分離總數的20.1%。劉勇[20]研究了不同放牧強度下甘南草地3年的植物病害發生規律，發現垂穗披堿草(Elymusnutans)的銹病(Pucciniarecondita)和離蠕孢葉斑病(Bipolarissorokiniana)為常見病害。陳仕勇等[21]發現麥角病(Clavicepsspp．)也是垂穗披堿草的一種常見病害。

垂穗披堿草(Elymusnutans)是青藏高原重要的優良牧草，亦是優勢植物種群，可與AM真菌形成共生體。由專性寄生真菌Blumeriagraminis引起的白粉病，是一種典型的氣傳性病害，也是青藏高原高寒草地的主要病害之一。主要侵害植物葉片，最初葉片兩面形成白色粉狀物，嚴重時全葉布滿白粉狀霉層。白粉病菌對寄主的危害比較嚴重，不僅造成鮮草產量的損失，還會影響牧草品質。目前，AM真菌與白粉菌等氣傳病害互作關系的報道尚不多見[22]，有必要加強此方面的研究，進一步探究AM真菌在病害防控方面的作用。此次在不同放牧強度區采集土壤，在溫室條件下建立不同土壤微生物及AM真菌處理，探討放牧及AM真菌對垂穗披堿草生長和白粉病的影響，以期為通過放牧調控微生物，提高植物抗病性提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 取樣地概況及放牧樣地設置

試驗樣地位于青藏高原東緣的甘肅省甘南瑪曲草原站，海拔3 500 m左右。主體土壤類型為亞高山草甸土，植被類型有垂穗披堿草(Elymusnutans)、老芒麥(E.sibiricus)、早熟禾(Poaannua)、翦股穎(Agrostisstolonifera)、羊茅(Festucaovina)等，線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)為優勢種。除線葉嵩草不能和AM真菌形成共生體外，其他主要禾本科建群種均可與AM真菌形成共生體[12]。放牧地設計分為輕度放牧(LG)、中度放牧(MG)和重度放牧(HG)3個放牧強度。放牧率以當地現行載畜量為基礎確定，放牧小區的面積為200 m×200 m。輕度放牧為8羊/輪牧小區，中度放牧為16羊/輪牧小區，各設6個輪牧小區，周期皆為45 d，放牧期7 d左右(根據氣候和牧草生長階段適度調整)；重度放牧為8羊/輪牧小區，放牧期間持續放牧，不輪牧。6～9月是放牧季節，輪牧周期為45 d,至試驗開始取樣時，已連續放牧4年。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試土壤 9月底，在每個輪牧小區沿對角線選取20個植被蓋度和群落相對一致的點，挖取5～15 cm土層土壤裝入自封袋，每個點150 g。輪牧強度相同小區共采集約50 kg土樣，用于溫室試驗。將瑪曲放牧地采集的土壤，挑揀其他雜物并混合均勻后過0.25 mm篩。

1.2.2 供試植物 垂穗披堿草(Elymusnutans)種子于2013年9月初從瑪曲放牧地采集獲得。挑選大小一致且籽粒飽滿的種子，用10% H2O2對其表面消毒10 min，然后用無菌水沖洗干凈，置于25℃恒溫培養箱催芽48 h。

1.2.3 供試AM真菌 根內球囊霉(Rhizophagusintraradices)和幼套球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)，購買于北京市農林科學院植物營養與資源研究所“叢枝菌根真菌種質資源庫BGC”，宿主為三葉草(Trifoliumrepens)，以擴繁所得的孢子、根外菌絲、菌根根段及培養基質(沙∶土= 9∶1)作為接種物。

1.2.4 試驗設計 將放牧地采集的土壤過篩后進行處理。

自然土(NS)：過篩土壤不經任何處理，保留原有的AM真菌和根部入侵真菌。

無菌土(SS)：采用高溫濕熱滅菌法，將土壤放入鐵桶，在高溫高壓滅菌鍋中，121℃滅菌1 h，隔日再滅菌1 h，消除土壤中的AM真菌和根部入侵真菌。

接種AM真菌土(AM)：將滅菌后的土壤裝入花盆至3/5處，各稱取15 g擴繁的混合菌劑平鋪在上面，然后再覆蓋無菌土至4/5處。

去除AM真菌土(NM)：將野外所采集土壤，用無菌水稀釋后，過濾(Whatman42號濾紙)2次，獲得不含AM真菌的濾液，然后將該濾液按10 mL/kg的比例加入上述滅菌土，獲得去除AM真菌土。

1.2.5 種植管理 種植盆數：放牧強度(3個)×土壤處理(4種)×重復(4次)=48盆。

將上述土壤，每盆裝入700 g，覆膜保濕。選取長勢、大小基本一致的萌發種子，移栽至塑料花盆中，每盆移栽5株，出苗1周后，定苗至3株。收獲前測定發病率，收獲時選取不同處理植株相同部位的新鮮葉片，用于生理生化指標測定。

1.3 指標測定

發病率統計：植株生長7周后，自然發生白粉病，每盆隨機選取20個葉片，記錄發病葉片數。

發病率=發病葉片數/20×100%。

染色鏡檢法測定AM菌根的侵染率[23]；全P含量采用鉬銻抗吸光光度法[24]測定；采用丙酮浸提法測定葉綠素含量[25]；采用氮藍四唑法和愈創木酚法測定超氧化物歧化(SOD)酶和過氧化物(POD)酶活性[26]，多酚氧化酶(PPO)含量采用王學奎的方法測定[25]。

1.4 數據統計與分析

采用JMP IN 4對各指標進行交互效應和方差分析，結果用Microsoft Excel 2010作圖。

2 結果與分析

2.1 AM真菌侵染率

以滅菌土(SS)和去除AM真菌土(NM)為基質的垂穗披堿草根系均未檢測到菌根結構。放牧強度對AM真菌侵染率產生顯著影響，AM處理不同放牧強度間的差異均顯著(P<0.05)。輕度、中度和重度放牧AM處理的侵染率分別較自然土(NS)高9.71%，18.4%和40.12%。NS和AM處理的侵染率都表現為重度放牧最高，比輕度和中度放牧分別高32.48%，2.39%和69.2%、21.17%(表1)。NS處理下中度和重度放牧的侵染率差異不顯著，但與輕度放牧差異顯著(P<0.05)(表1)。

表1 不同處理下的垂穗披堿草AM真菌侵染率Table 1 AM colonization of Elymus nutans under different treatments %

注：不同小寫字母表示同一土壤處理不同放牧強度間差異顯著(P<0.05)

2.2 白粉病發病率

放牧強度與土壤處理間存在交互效應，中度放牧除NS處理外的發病率最高。輕度放牧的AM，NM和NS處理的白粉病發病率比SS分別低22.1%，73.37%和36.65%，中度放牧低57.26%，25.46%和81.82%，重度放牧低20.46%，13.19%和65.05%。說明不同放牧強度下各接種真菌處理皆不同程度抑制垂穗披堿草白粉病的發生，降低了發病率(圖1)。此外，隨放牧強度的增加，AM真菌對白粉病發病率的降低無顯著差異，NM在低放牧強度下的抗病效果最為顯著，NS處理在中度放牧條件下顯著降低白粉病的發病率(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同處理下的垂穗披堿草白粉病發病率Fig.1 Powdery mildew incidences of Elymus nutans under different treatments注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 總生物量和根冠比

接種AM真菌和SS處理未對垂穗披堿草總生物量產生顯著影響，NS處理總生物量較無菌土和單接菌土壤均有不同程度的降低(圖2a)。

不同放牧強度的土壤及AM真菌處理對根冠比的影響與總生物量相似。此外，重度放牧土壤各處理間的差異更為顯著，SS處理比AM，NM和NS的根冠比分別高23.96%，45.12%和38.37%；重度放牧土壤NS處理的根冠比分別較輕度和中度放牧高126.32%和145.71%(圖2b)。

圖2 不同處理下的垂穗披堿草總生物量和根冠比Fig.2 Total biomass and root/shoot ratio of Elymus nutans under different treatments

2.4 全磷含量

不同放牧強度皆以接種AM真菌處理的地上全磷含量最高，但與SS和NM處理間的差異均不顯著(P>0.05)，自然土NS表現為最低，輕度、中度、重度放牧條件下NS處理分別較AM處理低41.78%，34.84%和29.30%(圖3a)。

放牧強度與AM真菌都對垂穗披堿草根系全磷含量產生顯著影響(P<0.05)，且二者間存在交互效應，接種AM土壤根系全磷含量隨放牧強度的增加先增加后降低，NM與NS土壤隨放牧強度增加而增加。AM真菌并未顯著增加根系全磷含量，其與SS間的差異不顯著(圖3b)。NM處理不同程度降低了根系全磷含量，中度放牧條件下降低24.14%。輕度、中度和重度放牧強度下，NS處理的根系全磷含量分別比SS降低53.74%，64.92%和21.95%(圖3b)。

圖3 不同處理下的垂穗披堿草全P含量Fig.3 Total P content of Elymus nutans under different treatments

2.5 葉綠素含量與光合速率

不同放牧強度土壤與AM真菌處理存在交互效應。輕度和中度放牧強度下，AM與NM處理皆提高垂穗披堿草的葉綠素含量，重度放牧強度下降低葉綠素含量。NS處理中度和重度放牧強度比低放牧強度高33.68%和21.00%(圖4a)。

放牧強度對光合速率產生顯著影響(P<0.05)。輕度、中度和重度放牧條件下SS和AM處理的光合速率都呈先降低后升高趨勢，重度比輕度和中度在SS處理下分別高36.71%和113.86%，在AM處理下分別高 18.68%和130.66%。輕度和中度條件下，AM處理的光合速率比NM分別低8.08%和17.96%，重度放牧下高18.68%(圖4b)。

2.6 抗病相關酶活性

不同放牧強度下的土壤及AM真菌處理對垂穗披堿草SOD酶活性的影響存在交互效應。AM真菌土壤的SOD酶活性隨放牧強度的增強而增強，重度放牧條件比輕度和中度分別高8.3%和11.07%，NM處理反之，輕度放牧的SOD酶活性最高，NS土壤對SOD酶活性的影響與AM土壤一致。中度和重度放牧條件下，同一真菌處理的SOD酶活性無顯著差異(圖5a)。

圖4 不同處理下的垂穗披堿草葉綠素含量與光合速率Fig.4 Chlorophyll content and photosynthetic rate of Elymus nutans under the different grazing treatments

中度放牧強度下，AM真菌顯著提高了POD酶活性；NM處理對POD酶活性的影響隨放牧強度的增加而增加，但無顯著差異，NS處理則表現為相反趨勢(P<0.05)(圖5b)。

不同放牧強度下AM，NM和NS處理的PPO酶活性的無顯著差異。AM真菌未對PPO酶活性產生積極影響，而NM處理顯著提高了垂穗披堿草的PPO酶活性，輕度、中度和重度放牧分別較SS提高14.2%，10.61%和19%。NS處理輕度放牧下的PPO酶活性比SS高11.57%，中度和重度放牧下的差異不顯著(圖5c)。

3 討論

放牧是典型草原生態系統中主要的土地利用方式和干擾模式，同時也是引起土壤養分含量發生變化的主要因素之一[27]。其通過動物的采食、踐踏及排泄物的輸入直接或間接對草地土壤產生影響，隨著放牧強度的增加，家畜啃食量加大，凋落物或死亡地被物的分解減少，進而減少土壤中的養分含量。而放牧強度高的草地，家畜又會排泄更多的糞尿，能夠增加土壤中的養分含量[28]。磷為貯藏性物質，受外界環境的影響較大。戎郁萍等[29]和Xie等[30]探究了不同放牧強度對草地土壤理化性質的影響，結果表明隨放牧強度的增加，土壤全磷含量逐漸降低；周麗艷等[31]研究不同放牧強度對貝加爾針茅(Stipabaicalensis)草甸草原的影響結果也顯示，土壤狀況隨著放牧強度的增加而劣由于放牧同時影響著植物的地上及地下土壤理化性質，而這些因素又是影響AM真菌生長及其多樣性的直接因素，因此放牧對AM真菌的影響是一個較為復雜的過程[9，34-36]，且隨放牧強度不同，AM真菌的侵染能力也存在差異。有研究認為放牧對AM真菌有促進作用，如Klironomos等[37]關于食草行為對AM真菌影響的報道稱，食草行為雖抑制了根內菌絲和叢枝的生長，但對泡囊和孢子的生成有促進作用。Techau等[38]以豌豆作為研究對象，進行模擬食草試驗，發現高頻率的食草行為可促進AM真菌的侵染，尤其在宿主植物缺乏磷營養的狀況下。另外，Ba等[39]在吉林省羊草(Leymuschinensis)草原上比較研究不同放牧強度對草地的影響，結果表明輕度和中度放牧區AM真菌多樣性高于重度放牧區。相反，也有一些研究認為放牧未對AM真菌產生顯著影響。Duponnois等[40]比較研究不同年限休耕地上放牧區和圍欄禁牧區的AM真菌，結果顯示兩個區域內的真菌孢子數量和對本土植物的侵染并沒有顯著差異，即圍欄或放牧對真菌的生長和侵染能力沒有影響，Medina-Roldán等[41]的研究進一步驗證了這一結論。研究顯示，中度和連續放牧土壤的侵染率均顯著高于輕度放牧土壤，AM真菌對放牧行為的敏感性，主要歸結于放牧對植物和土壤因子的影響，而這些因素的改變又影響AM真菌的產孢和侵染。

圖5 不同處理下的垂穗披堿草抗病相關酶活性Fig.5 Defensive enzyme activities of Elymus nutans under different treatments

AM真菌能夠改善宿主的水分代謝和養分狀況，促進植物生長，改善根際微生物環境[42-43]。試驗含AM真菌土壤顯著增加了根系的全磷含量，這是因為菌根化植物對土壤中磷元素的攝取包括直接吸收途徑(DUP)和菌根吸收途徑(MUP)兩條，且MUP途徑對磷吸收的貢獻更大[44]。中度和連續放牧條件下，含AM真菌土壤的總生物量以及根冠比顯著高于其他處理，這與放牧強度和AM真菌的綜合作用息息相關，放牧通過影響AM真菌特性和土壤理化性質來間接影響植物生長。

AM真菌表面分布有大量菌絲體，構成對病原物的天然屏障[45]；增加了細胞壁的木質化程度和羥脯氨酸糖蛋白含量，使植物根尖表皮增厚，防止病原物的入侵[45]；增加抗病成分的合成，與病原菌競爭結合部位，增強了植物的抗病性[46]。劉貴猛等[47]的研究表明，作為重要的生防種質資源，AM真菌與PGPR能夠相互促進、協同抑制生姜(Zingiberofficinale)青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)的繁殖和侵染。周修騰等[48]在AM真菌對丹參(Salviamiltiorrhiza)木質部結構及防御相關基因的影響中發現，AM真菌能夠促進丹參生長，增加丹參根系木質部面積及密度，促進木質素的合成，對提高丹參抗病性有積極作用。Bruisson等[22]對葡萄藤(Vitisvinifera)白粉病(B.cinerea)的研究表明，AM真菌可誘導植物產生芪類化合物(stilbenoid)，促進PAL酶相關基因的表達上調，從而提高植物對白粉病的抗性。試驗含AM真菌土壤皆不同程度抑制垂穗披堿草白粉病的發生，降低發病率，且對抗病相關酶活性產生顯著影響，隨放牧強度的增強AM真菌處理的SOD酶和PPO酶活性升高。

病原菌的侵染會破壞植物葉片的綠色組織，從而使光合作用受到嚴重影響，直接導致產量下降[49]。白粉病菌(S.fuliginea)侵染的黃瓜(Cucumissativus)葉片光合膜上全鏈電子傳遞速率和光系統Ⅱ的電子傳遞速率都受到明顯抑制。光合膜在一定范圍內，隨著病原菌侵染的加強，可能出于對自身的保護，會通過降低電子傳遞速率來盡可能減少病原菌侵染的傷害[50]。輕度和中度放牧條件下，AM真菌皆顯著提高垂穗披堿草的葉綠素含量和光合速率，減輕白粉病對植物葉片的損傷，降低發病率，這與Bruisson等[13]對葡萄藤白粉病的報道相似，主要原因是AM真菌一方面促進了植物養分吸收和生長，另一方面可調節植物生理及光合作用，進而對白粉病起到防控作用。

4 結論

在瑪曲高山草原地區，適當地增加放牧強度，可提高AM真菌侵染率9.71%～40.12%。AM真菌通過提高宿主根系全磷含量、葉綠素含量和光合速率，促進植物生長，調節抗病相關酶活性，可使得垂穗披堿草白粉病發病率降低20.46%～57.26%，有效抑制病害的發生。

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