高通量測序分析中國沙棘根瘤與根際土壤細菌多樣性

張愛梅，韓雪英，孫 坤，張世虎，孔維寶，牛世全，朱學泰 (西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070)

中國沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)是一種落葉灌木或喬木，抗逆性極佳，對土壤適應性強，常生于海拔800～3 600 m的礫石，沙質土壤或黃土。我國西北地區大規模種植沙棘，既可進行生態綠化，又可作為經濟林樹種[1]。沙棘是一種典型的放線菌結瘤植物，沙棘根系發達，能與弗蘭克氏菌屬(Frankia)形成根瘤進行共生固氮，提高土壤肥力[2-3]。沙棘根際土壤的微生物類群非常豐富，根際土壤中微生物數量及種類的分布也呈現復雜的多樣性[4]。根際是植物根系直接影響的土壤范圍，生存于植物根際土壤中的微生物，稱為根際微生物[5]。根際微生物與植物根系組成一個特殊的生態系統，根際土壤微生物的數量和群落結構及其變化與植物生長發育有著重要的關系，對研究微生物與植物的互利共生，探索生物多樣性和生態系統功能有著重要的影響[6-7]。

對沙棘根瘤的研究發現，沙棘根瘤中的微生物主要是放線菌Frankia[8]，除此之外還包括一些非Frankia內生菌[9]。對沙棘根際土壤微生物的研究發現，沙棘根際土壤中有豐富的微生物種類[10-11]。因此，通過采用高通量測序技術，研究中國沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌多樣性，并對中國沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌群落結構進行比較，初步探究中國沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌之間的關系，為進一步研究中國沙棘根瘤內生細菌的來源提供依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗樣地位于甘肅省蘭州市馬銜山，樣地信息見表1所示。于2016年9月在采樣地選取3株中國沙棘植株，采集沙棘根瘤和沙棘根際土壤，帶回實驗室保存備用。

1.2 沙棘根瘤內生菌總DNA提取

選取新鮮幼嫩的沙棘根瘤樣品，除去沙棘根瘤表面的泥沙等雜質，依次用自來水，蒸餾水和無菌水沖洗。然后用75%乙醇和1%NaClO溶液進行表面消毒，再用無菌水反復沖洗，收集最后一次沖洗的無菌水進行無菌檢測[12]。將沙棘根瘤表面消毒后，采用CTAB法提取沙棘根瘤內生菌總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的效果[13-14]。

表1 樣地基本信息Table 1 The information of sample site

1.3 沙棘根際土壤總DNA提取

1.4 16S rDNA-V4區PCR擴增

沙棘根瘤內生細菌與沙棘根際土壤細菌16S rRNA-V4區的PCR擴增采用帶Barcode的特異性引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R(5′-GCCAATGGACTAHVGGGTWTCTAAT-3′)[15]。PCR擴增采用50 μLPCR擴增體系，擴增反應條件為98℃預變性5min，98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品4℃保存備用。

1.5 文庫構建和上機測序

1.6 高通量測序數據處理

將測序得到的原始數據截去Barcode和引物序列后進行拼接，拼接得到的序列經過嚴格的過濾，并去除其中的嵌合體序列得到最終的有效數據。再利用Uparse軟件對樣品的全部有效序列在97%水平上進行OTU聚類，并篩選出OTU中出現頻率最高的序列作為OTUs代表序列，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析，并在各個水平上統計樣品的群落組成。

1.7 沙棘根瘤內生細菌多樣性分析

沙棘根瘤內生細菌多樣性分析采用Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和ACE指數[16-18]。

Shannon 指數：

Simpson 指數：DSimpson=1-∑pi2

式中：Pi為第i個物種的OTU數占總OTU數的比例，表明第i個物種的相對豐度，可用Pi=Ni/N求出，Ni為第i個物種OTU數；N為總OTU數。S為每個樣品的物種總數；F1為檢測到的singletons數目；F2為檢測到的doubletons的數目；Sabund為優勢OTU的數目；Srare為稀有OTU的數目；Cace為樣品的豐度估計值；γ2為樣品中稀有OTU的變異系數。

2 結果與分析

2.1 中國沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌OTUs數目統計及物種注釋

將中國沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌分別進行高通量測序，對注釋結果和OTU聚類進行統計(表2)。沙棘根瘤內生細菌的測序覆蓋度為99.7%，根際土壤細菌測序覆蓋度為97.5%，表明測序數據合理可靠。在沙棘根瘤內生細菌中檢測到的OTU聚類及后續分析的有效序列(Total-tag)比根際土壤細菌中檢測到的多7 076條，用于構建OTUs并獲得注釋信息的序列(Taxon-tag)比根際土壤細菌中檢測到的多10 227條。在97%相似度下對所有序列進行OTU劃分，在根際土壤細菌中檢測到的OTU數為根瘤內生細菌的15.66倍。

對OTU代表物種進行物種注釋，并比較沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌的物種注釋信息，找到其共有的和特有的物種，繪制韋恩圖(圖1)。沙棘根瘤內生細菌特有的OTU有51個，占沙棘根瘤內生細菌總OTU的21.98%；沙棘根際土壤細菌特有的OTU有3 452個，占根際土壤細菌總OTU的95.01%。沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌共有的OTU有181個，占沙棘根瘤內生細菌總OTU的78.02%，占根際土壤細菌總OTU的4.99%。

表2 中國沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌序列數Table 2 Sequences number of root nodules endophytic and rhizosphere soil bacteria of Hippophae rhamnoidoes subsp. sinensis

圖1 OTU韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTU注：圖中M為根際土壤細菌；MR為根瘤內生細菌

2.2 沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌多樣性

Alpha多樣性指數可以反映各群落內微生物多樣性的豐富度。將沙棘根瘤內生細菌與沙棘根際土壤細菌的微生物多樣性指數進行統計(表3)。沙棘根際土壤細菌Shannon指數、Chao1指數和ACE指數分別是沙棘根瘤內生細菌的1.59倍，12.33倍和11.84倍，說明根際土壤細菌的微生物多樣性和豐度都比根瘤內生細菌的高。根際土壤細菌Simpson指數是根瘤內生細菌的1.59倍，說明根際土壤細菌均勻度比根瘤內生細菌好，且根際土壤細菌優勢OTU比根瘤內生細菌多。

表3 沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌微生物多樣性指數Table 3 Microbial diversity index of root nodules endophytic bacteria and rhizosphere soil bacteria of Hippophae rhamnoidoes subsp. sinensis

2.3 沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌群落結構

對OTU代表序列進行物種注釋，獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計樣本的群落組成(表4)。

表4 不同分類水平的細菌群落組成Table 4 Bacteria community structure at different classification levels

在門、綱、目、科和屬等不同分類水平，沙棘根際土壤樣品中檢測到的微生物種類都比根瘤樣品中檢測到的微生物種類多，且分類水平越低，微生物差異就越明顯，在目、科和屬水平，根際土壤樣品的微生物物種數分別是根瘤樣品中的3.46倍，3.68倍和4.40倍。

在門分類水平，將沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌中豐度前10的類群進行統計(表5)，在沙棘根瘤內生菌中，Actinobacteria和Proteobacteria為優勢類群，其相對豐度分別為94.16%和5.46%，占到所有內生細菌類群的99.62%。在沙棘根際土壤中，Proteobacteria，Actinobacteria和Acidobacteria為優勢類群，其相對豐度分別為31.41%，27.28%和15.81%。在沙棘根際土壤中，相對豐度居前10的類群占到所有細菌類群的96.20%。在門分類水平，將沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌中相對豐度居前10的物種進行比較，發現沙棘根瘤內生細菌相對豐度居前10的物種在根際土壤細菌中均存在，但根際土壤細菌中Thaumarchaeota的細菌在根瘤內生細菌中沒有分布。

表5 中國沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌相對豐度前10的門Table 5 The top 10 phyla of relative abundance of root nodules and rhizosphere soil bacteria of Hippophae rhamnoidoes subsp. sinensis

在屬分類水平，將沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌中相對豐度居前10的屬進行統計(表6)，在沙棘根瘤內生菌中，Frankia菌屬為優勢屬且占絕對優勢，其相對豐度為93.21%。在沙棘根際土壤中，Gaiella、Bacillus、Solirubrobacter、Arthrobacter、Stenotrophomonas為優勢屬，其豐度分別為1.99%、1.87%、1.87%、1.84%和1.21%。在屬分類水平，將沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌中相對豐度居前10的物種進行比較，發現沙棘根瘤內生細菌相對豐度居前10的物種在根際土壤細菌中均存在，但根際土壤細菌中Solirubrobacter和Blastococcus的細菌在根瘤中沒有分布。

表6 中國沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌相對豐度前10的屬Table 6 The top 10 genera of relative abundance of root nodules and rhizosphere soil bacteria of Hippophae rhamnoidoes subsp. sinensis

在門和屬分類水平進行比較發現，沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌的群落組成既有相似性又存在一定的差異，尤其是細菌的豐度在兩種樣品間存在較大差異。在沙棘根瘤內生細菌中Frankia占93.21%，而在根際土壤細菌中僅占0.02%。同時還發現，與沙棘根瘤內生細菌相比，沙棘根際土壤細菌的均勻度較好，優勢物種較多。

在屬分類水平，將沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌中相對豐度居前10的特有屬進行統計(表8)。可見，在屬分類水平，沙棘根瘤內生細菌特有的相對豐度居前10的物種分別為Lactobacillus、Aeromonas、Shewanella、Pelosinus、Buchnera、Blautia、Lactococcus、Anaerofustis、Sedimentibacter、Syntrophomonas。其中Lactobacillus相對豐度達到0.02%，其他屬的相對豐度均未達到0.01%。沙棘根際土壤細菌特有的相對豐度居前10的屬分別為Solirubrobacter、Candidatus-Alysiosphaera、Blastocatella、Microvirga、Skermanella、Marmoricola、Pirellula、Nitrosococcus、Rubrobacter和Terrimonas。其中Solirubrobacter相對豐度為1.87%，Candidatus-Alysiosphaera和Blastocatella相對豐度為0.79%，其他屬相對豐度均在0.2%以上。

表7 中國沙棘根際土壤細菌在門水平相對豐度居前10的特有類群Table 7 The top 10 of peculiar phylum bacteria in rhizosphere soil of Hippophae rhamnoidoessubsp. sinensis

表8 中國沙棘根瘤內生細菌和根際土壤細菌在優勢屬水平相對豐度居前10的特有類群Table 8 The top 10 of peculiar genus bacteria in root nodules and rhizosphere soil of Hippophae rhamnoidoes subsp. sinensis

3 討論

沙棘根瘤是沙棘根部受到Frankia侵染形成的共生結構，這種共生結構使內生菌和宿主植物在生理結構、營養物質的輸送以及能量分配等方面達到一定平衡，維護內生菌和宿主植物的共生生活。徐瑞瑞[9]在研究沙棘根瘤時，發現在沙棘根瘤內生菌中，除了與沙棘共生的Frankia外，還有非Frankia內生菌存在于根瘤中。此次研究結果也表明，沙棘根瘤內生菌中Frankia為優勢微生物，其相對豐度占到93.21%，除了Frankia外，沙棘根瘤內生菌中還有92個屬的細菌，具有豐富的多樣性。邱并生[16]和吳立娟等[17]在研究豆科植物與根瘤菌共生關系的過程中，發現根瘤中可以同時存在共生根瘤菌和非共生根瘤菌。可見，非豆科植物沙棘根瘤中，內生菌也具有豐富的多樣性，且同時存在共生根瘤菌和非共生根瘤菌。

研究發現，沙棘根際土壤細菌多樣性比根瘤內生細菌要豐富。沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌群落組成既有相似性，又存在差異。沙棘根瘤內生細菌中有78.02%的OTU是與根際土壤共有的，門和屬分類水平微生物群落組成分析也發現，沙棘根瘤內生細菌中存在的微生物在根際土壤細菌中也有分布。許多內生菌屬于兼性內生，不僅存在于植物組織內部，也存在于根際土壤中，根際土壤是植物內生菌的主要來源[18-19]。在沙棘根瘤內生細菌中，優勢門Proteobacteria所占比例為5.46%；而在沙棘根際土壤細菌中，其所占比例為31.41%，是絕對優勢門。有研究表明，Proteobacteria是植物根際最為豐富的優勢菌群，這與其生長速度快，能廣泛利用各種根際分泌物有關[20]。

沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌具有相似的群落組成，說明沙棘根瘤內生細菌中的一些細菌可能來源于根際土壤。在沙棘根瘤內生細菌中，Frankia所占比例為93.21%，而在沙棘根際土壤細菌中，其所占比例僅有0.02%。袁長芳[21]對山西不同土壤沙棘Frankia的數量和分布進行研究，發現地表生長沙棘的土壤中含有大量的Frankia，未生長沙棘的土壤中也有Frankia存在，Frankia應該作為土壤微生物的固有種群。在沙棘根際土壤中，除了Frankia外，還有大量其他的細菌存在[21]。但沙棘根瘤是由Frankia侵染引起的，Frankia侵染沙棘根部形成根瘤后，由于根瘤內的環境更適合Frankia生長繁殖，所以根瘤內Frankia含量遠遠高于根際土壤中的Frankia，有關沙棘根瘤內Frankia的侵染機制及途徑還需進行進一步研究。

4 結論

采用高通量測序技術研究中國沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌多樣性，檢測到中國沙棘根瘤內生細菌共10門93屬，中國沙棘根際土壤細菌共39門409屬，根瘤和根際土壤細菌均具有豐富的多樣性，但根際土壤細菌比根瘤內生細菌多樣性豐富。將中國沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌群落結構進行比較，在沙棘根瘤中檢測到的大部分細菌在沙棘根際土壤中都有分布，由此可以推測沙棘根瘤中的一些內生細菌可能來源于根際土壤。但相同種類的細菌，在沙棘根瘤內和根際土壤中的相對豐度具有較大差異，除此之外，在沙棘根瘤內與根際土壤中均檢測到了特有的細菌類群。因此中國沙棘根瘤內生細菌與根際土壤細菌群落結構既有相似之處又存在一定的差異。

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