紅三葉AFLP體系的建立及優化

蒲小劍，田久勝，田新會，杜文華(.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； .甘肅農業大學植物保護學院，甘肅 蘭州 730070)

擴增片段長度多態性(AFLP)是由RFLP與RAPD結合而成的一種新的分子標記技術，具有RFLP標記和RAPD標記的優點，有“最有力的分子標記”或“下一代分子標記”的稱號[7]。因其高多態性，可靠，高效[8]，DNA用量少，檢測率高[9]，重復性高，加上選擇為中性[10]等許多優點，AFLP技術普遍應用于生物研究領域。近年來，AFLP技術在牧草種質鑒定方面的應用發展迅速，在紫花苜蓿(Medicagosativa)[11]，燕麥(Avenasativa)[12]，狗牙根(Cynodondactylon)[13]，老芒麥(Elymussibiricus)[14-15]，扁蓿豆(Medicagosativa)[16]，鴨茅(Dactylisglomerata)[17]等牧草的鑒定中均有報道。孟麗娟[18]通過對來自美國、加拿大和俄羅斯的31份紅三葉材料運用ISSR分子標記建立并優化了適宜紅三葉ISSR分析的最佳反應體系，擴增出58條多態性條帶，后通過UPGMA聚類分析將試驗材料分為5類。Mamta Gupta等[19]使用36對簡單序列重復(SSR)引物分析全球收集紅三葉材料的遺傳多樣性，其擴增片段1～6個，多態性值0.301～0.719，貝葉斯聚類模型分析將研究材料分為3類。Herrmann等[20]利用優化AFLP體系探索了野生和栽培紅三葉群體的遺傳特性和親緣關系。Muntean等[21]用AFLP分子標記對紅三葉品種遺傳多樣性進行了評價。雖然AFLP技術的原理簡便，但步驟繁多，從酶切反應到銀染成像的優化，若一個步驟或條件不合適，就出現帶型不穩定、條帶不清晰和多態性偏低等問題。所以，以岷山紅三葉和紅三葉新品系為試驗材料，篩選AFLP優化條件，旨在建立適宜紅三葉的AFLP反應體系，為紅三葉分子遺傳研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

田間試驗在甘肅省臨洮縣臨洮農校農場進行，地理位置E 103°87′，N 35°37′，海拔1 892 m，降水量562 mm，無霜期80～190 d，年平均氣溫7.0℃(最高氣溫34.6℃，最低氣溫-29.5℃)。土壤為黑麻土，肥力均勻，有灌溉條件，前茬作物為玉米。

1.2 試驗材料

試驗材料為以岷山紅三葉為父本(Male parent，M)、抗白粉病紅三葉新品系(甘農PR1)為母本(Female parent，F)雜交形成的F1代群體，以及2親本。2015年3月下旬將雜交F1代種子點播，株距20 cm，行距30 cm，播種深度1(2 cm，得到F1代群體。于生長期間采摘幼嫩葉片1～2 g，放入液氮保存，帶回實驗室-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3 試驗試劑與儀器

MseI，EcoRI和T4DNA連接酶購自Thermo Scientific，2×PCR Master Mix與DNA Marker購于BBI Life Sciences。引物及接頭(表1)上海生工生物工程有限公司人工合成，其他試劑均為國產分析純。

試驗所用儀器見表2。

表1 接頭和引物序列Table 1 Sequence of the adapter and primer

表2 試驗儀器Table 2 Experimental instrument

1.4 基因組DNA制備及檢測

采用改進CTAB法[22-23]提取紅三葉基因組DNA。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，TE稀釋后用超微量紫外分光光度計檢測D260nm/D280nm，D260nm/D230nm，以確定DNA的純度與濃度。

1.5 體系優化篩選條件

體系優化篩選條件：酶切時間，DNA濃度，EcoRI、MseI濃度見表3；預擴增體系見表4，選擇性擴增體系進行優化設計見表5。

表3 優化體系篩選條件設計及篩選結果Table 3 Optimization system screening conditions design and screening results

表4 預擴增正交體系設計Table 4 Orthogonal design for pre-amplification

表5 選擇性擴增引物組合編號Table 5 Primer numbers

注：E代表EcoRI，M代表MseI。

1.6 AFLP反應體系

1.6.1 基因組DNA雙酶切 選取2種限制性內切酶EcoRI/MseI，反應體系共20 μL。包含，10×Tang buffer 3 μL，模板DNA(200～300 ng/μL)9 μL，8 UEcoRI，6 UMseI，ddH2O補平。雙酶切時間，37℃水浴5 h、65℃水溶15 min。-20℃保存酶切產物。

1.6.2 接頭連接 合成的單鏈人工接頭稀釋至50 μmol/L，經PCR反應合成雙鏈，加入3 U T4DNA連接酶，于22℃下連接過夜。

1.6.3 AFLP預擴增反應 反應總體系30 μL，包括4 μL連接產物模板DNA，0.8 μLEcoRI，0.6 μLMseI預擴增引物，15 μL 2×PCR Master Mix，ddH2O補平，離心混勻進行PCR反應。

1.6.4 AFLP選擇性擴增反應 反應總體系20 μL，包括2 μL稀釋10、20、25、30、40、50倍的預擴增產物(稀釋30倍)；0.8 μL Primer E，1.0 μL Peimer M，2×PCR Master Mix6、7、8、9、10和11 μL；ddH2O補平后進行PCR反應。

1.6.5 擴增產物檢測 制備4%變性聚丙烯酰胺凝膠，待膠聚合后預電泳30 min。選擇擴增產物(2 μL)與上樣Buffer混勻，經90℃變性3 min，置于4℃保存等待點樣。點樣后1 500 V恒功率電泳1.5 h左右，停止電泳。采用Carlos銀染方法[22-23]，膠版微干后拍照、統計數據。

2 結果與分析

2.1 DNA提取質量和檢測

AFLP反應對DNA質量要求較高。高質量的DNA是獲得重復性好、條帶清晰AFLP擴增結果的關鍵因素。采取改良CTAB法提取紅三葉基因組DNA。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示所提取的紅三葉基因組DNA條帶清晰、整齊、無拖尾(圖1)。經超微量紫外分光光度計檢測，D260nm/D280nm在1.7～1.9，D260nm/D230nm約為2，濃度在200 ng/μL。說明所提取DNA純度高，濃度適中，能夠達到下一步試驗要求。

圖1 紅三葉基因組DNA電泳檢測Fig.1 Agarose gel-electrophporesis of redclover genomic DNA注：1，2分別為紅三葉DNA在1 %瓊脂糖凝膠檢測結果

2.2 酶切、連接體系優化

2.2.1 酶切時間優化 采用EcoRI和MseI進行基因組DNA酶切，識別序列分別為GAATTC和AATT。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。其DNA片段均在100～1 500 bp，表明酶切充分，符合試驗要求(圖2)。1～5條帶亮度逐漸增加，6稍暗于5。因此酶切時間選用37℃ 5 h，65℃ 20 min。

圖2 酶切時間優化電泳圖Fig.2 Agarose gel-electrophporesis of gradientextracted enzyme digestion time注：1～6分別為3,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 h酶切連接瓊脂糖電泳帶型，M為D2000分子量標記

2.2.2 DNA濃度篩選 40～90 ng/μL電泳條帶亮度逐漸變大，100 ng/μL條帶亮度暗于90 ng/μL。90 ng/μL DNA進行酶切反應(圖3)。

圖3 DNA濃度篩選電泳圖Fig.3 Agarose gel-electrophoresis of different DNA concentrations注：1～7的DNA濃度分別為40、50、60、70、80、90、100 ng/μL，M為D2000分子量標記

2.2.3EcoRI濃度篩選 電泳結果(圖4)表明，1～4條帶亮度隨內切酶EcoRI濃度增加變大，而5、6條帶亮度暗于4。EcoRI濃度篩選結果為8 U。

圖4 EcoRI濃度篩選電泳圖Fig.4 Agarose gel-electrophoresis of different EcoRI concentrations注：1～6的EcoRI濃度分別為2、4、6、8、10、12 U，M為D2000分子量標記

2.2.4MseI濃度篩選 電泳結果(圖5)表明1、3條帶明顯亮于其他條帶，3的條帶亮度最大。MseI濃度篩選結果為6 U。

2.3 預擴增體系的優化

根據表2設計的16個PCR擴增結果圖。整體效果不理想，僅第4與第6有條帶。第6條帶的亮度明顯優于第4條帶。因此，預擴增體系為，連接產物，4 μL(稀釋10倍)；Primer E0，0.8 μL；Peimer M0，0.6 μL；2×PCR Master Mix，15 μL；ddH2O，9.6 μL(圖6)。

圖5 MseI(Trμ9I)濃度篩選電泳圖Fig.5 Agarose gel-electrophporesis of different MseI (Trμ9I) concentration注：1～6的MseI(Trμ9I)濃度分別為2、4、6、8、10、12 U，M為D2000分子量標記

圖6 預擴增正交設計電泳圖Fig.6 Agarose gel-electrophporesis on orthogonal design of pre-amplification注：1～16代表正交體系編號，同表4

2.4 選擇性擴增體系優化

2.4.1 預擴增產物稀釋倍數篩選 在眾多因素中，預擴增產物稀釋的倍數對選擇性擴增效果的影響最大。為使條帶清晰、穩定，預擴增產物被稀釋不同倍作比對試驗，結果顯示，最適宜的擴增效果是稀釋30倍(圖7)。

2.4.2 2×PCR Master Mix用量篩選 2×PCR Master Mix是即用型的常規PCR預混合溶液，含有TaqDNA Polymerase，dNTP混合物，MgCl2以及優化的緩沖體系，只需加入引物和模板即可進行擴增(圖8)，其用量大小會直接影響PCR結果。瓊脂糖凝膠電泳表明，10 μL PCR產物電泳條帶最亮，7 μL PCR產物次之，6 μL PCR產物最暗。

選擇性擴增體系：預擴增產物，2 μL(稀釋30倍)；Primer E，0.8 μL；Primer M，1.0 μL；2×PCR Master Mix，10 μL；ddH2O，6.2 μL。

圖7 預擴增產物稀釋倍數處理下選擇性擴增Fig.7 Effects of pre-amplification product diluted multiples on selective amplification注：1～6分別為5、10、15、20、25、30、40倍Mix用量，M為D2000分子量標記

圖8 2×PCR Master Mix用量處理下選擇性擴增Fig.8 Effects of concentration of 2×PCRMasterMix on selective amplification注：1～6分別為6、7、8、9、10、11 μL 2×PCR Master稀釋，M為D2000分子量標記

2.4.3 引物對的篩選 從8條EcoRI酶切位點接頭選擇性引物和8條MseI酶切位點接頭選擇性引物組合共計64對選擇性引物中篩選。只有1對引物組合沒有擴增出條帶，2對引物擴增結果與其他引物組合擴增條帶重復，其余引物組合均能獲得較清晰條帶。其中31對引物的擴增圖譜(圖9)。選取16對條帶清晰且條帶數較多的引物組合進行后續分析。

3 討論

AFLP被認為是十分理想、高效的分子標記技術，己經被廣泛應用到水稻等作物的遺傳多樣性分析、種質鑒定、基因定位和連鎖圖譜構建等方面[24]。AFLP試驗分析中，DNA模板限制性內切酶酶切是否充分、酶切片段T4DNA連接酶的連接是否成功是影響AFLP試驗成功與否的關鍵，限制性內切酶及 T4DNA連接酶的用量根據模板 DNA量而定[25]。AFLP可采取單酶切、雙酶切，據報道TE-AFLP用3種酶進行酶切反應[26]。雙酶切具有DNA片段長度較小，易于分離擴增產物等優點，因此得以大量應用于試驗研究。高品質基因組DNA的提取，是AFLP反應體系成功建立的關鍵[27]，若含有質量較差的DNA時，試驗結果的穩定性將會受到很大影響[28-29]。試驗用于酶切的DNA經檢測D260 nm/D280 nm的比值在1.7～1.9，純度較高。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，不含RNA和其他雜質，完全達到了AFLP技術的要求。雙酶切反應中，限制性內切酶對DNA的酶切必須完全徹底，否則擴增后變性聚丙烯電泳會出現多而密、中下部擴增帶稀少的現象，EcoRI較MseI敏感，更容易受DNA質量和體系中各成分的影響，因此在酶切反應中，采用EcoRI酶切緩沖液作為雙酶切的緩沖液。

圖9 引物篩選電泳圖Fig.9 Agarose gel-electrophporesis of primer screening注：M為DNA Marker(BBI Life Sciences)

AFLP反應中，不同材料的酶切時間、預擴增產物的稀釋倍數和選擇性擴增引物濃度這3個關鍵反應條件有所不同[30-31]。蔡麗艷等[11]構建苜蓿cDNA-AFLP反應體系的酶切時間為37℃ 6 h，65℃ 20 min。劉歡等[12]構建燕麥AFLP體系酶切的時間為37℃ 4 h，65℃ 15 min。引物濃度是反應體系的重要組成部分，對試驗結果影響比較大[32]。如果引物濃度偏低，PCR效率也會降低，擴增產物產量也相應減少；如果引物濃度偏高，可能會發生異位引導，導致非特異性意外擴增，影響試驗結果的準確性[33]。試驗為2種引物分別設置了6個引物濃度梯度，并篩選出了最優濃度。

AFLP操作時，由于膠板點樣口限制，同一對引物所擴增出的所有樣需分批進行點樣、跑膠，這就造成了不同玻璃板之間顯影的差別，人工統計條帶時，人為因素造成的誤差會降低AFLP技術的有效性。因此，為了提高試驗的精確性，試驗對引物初步篩選后，選出16對引物(點樣板最多點樣32個)對紅三葉新品系和岷山紅三葉進行多樣性分析，篩選出11對清晰的擴增條帶且多樣性豐富的引物組合進行下一步實驗。

4 結論

通過對決定AFLP體系的DNA濃度，酶切時間，兩酶EcoRI和MseI濃度，預擴增產物稀釋倍數，2×PCR Master Mix用量，引物組合等7個要素進行篩選，逐一篩選出對應上述要素的最優化量。分別為90 ng/μL，5 h，8 U，6 U，30倍，10 μL，構建了AFLP優化體系。按照篩選結果得到31條清晰條帶。并選出11條進行后續分析。

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