半胱氨酸合成酶復合體形成機制的研究進展*

蔣 安 楊 衛 黃德均 高立芳 張 健 向白菊**

（1 重慶市畜牧科學院 重慶 400015 2 重慶市璧山區河邊畜牧獸醫站 重慶 402760）

細胞生成過程取決于2 種或多種蛋白質與大分子復合物的可逆和特異性結合。這種蛋白質復合物的形成可以是暫時的，也有形成后長期處于穩定狀態的，其功能主要是參與細胞中DNA 復制、轉錄、信號傳導和代謝等過程［1］。目前信號傳導途徑中蛋白質-蛋白質相互作用已經得到廣泛深入的研究，但對于初級或次級代謝途徑中多酶復合物形成的分子機制的研究還相對較少。在初級代謝中，蛋白質-蛋白質相互作用可通過特定途徑形成最佳數量的多蛋白復合物。復合物中反應底物的代謝通道位于不同酶活性位點之間，在大分子組裝形成時具有較大優勢，不僅如此，復合物中各種酶的相互作用也都具有重要的調節功能，例如在植物和細菌的半胱氨酸（cystaine Cys）生物合成途徑中發生的多酶復合體現象即如此［2］。

存在于微生物和植物細胞中的半胱氨酸合成酶（cystaine synthase EC 4.2.99.8），大小約為60～70 kda，是一個同源二聚體［3］。它也被稱為O-乙酰絲氨酸硫解酶［O-acetylserine （thiol） lyase OASTL］。OASTL 的功能是以2 分子的5′-磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate PLP）作為輔助因子，催化O-乙酰絲氨酸（O-acetylserine OAS）和硫化氫合成半胱氨酸（Cys），這個反應過程如圖1所示。這是自然界中的無機硫摻入到Cys 的最后一步反應，通過這個反應無機硫可以轉化為有機硫。但生物對無機硫的吸收利用遠非如此簡單，例如植物根系利用土壤中硫酸鹽需要歷經吸收、轉運、同化、分配等過程。這些代謝過程由半胱氨酸合成酶（OASTL）等一系列酶和蛋白質參與和調節。在細菌中，無機硫也是通過此反應摻入半胱氨酸，再由半胱氨酸轉化成其他含硫化合物，例如蛋氨酸和谷胱甘肽。而動物體內因為不存在OASTL，沒有這些代謝過程，更沒有將其轉化成有機硫的各種調節機制，所以動物只能依靠吸收植物或微生物中的有機硫，才能滿足體內對硫元素的需要，因此該反應處于自然界硫循環過程的關鍵環節，被認為是關鍵反應。

此外，由于從碳和氮的同化途徑中得到的OAS，是合成半胱氨酸的前體物質，生成OAS 的反應由絲氨酸乙酰轉移酶（SAT，EC 2.3.1.30）催化，所以OASTL 和SAT 不但是自然界中硫循環的關鍵酶，對于硫在其同化途徑中的流通來說，OASTL 和SAT 的活性還具有更為特殊的意義，因為通過OAS 合成這個中間環節，OASTL 和SAT 將硫的同化途徑和氮、碳的同化途徑相聯系，并且能對這些途徑的平衡產生影響［5］。

1 OASTL 和SAT 復合體

植物和細菌中的OASTL 主要存在于細胞的胞質、質體和線粒體中，并有多種異形體。SAT 主要催化半胱氨酸的前體物質OAS 的合成，它同樣也出現在細胞的胞質、質體和線粒體中。SAT 和OASTL 能通過相互作用形成CSC［6］，目前已查明，二者的相互作用在Cys 的合成調節中處于核心地位。Kredich［3］在研究鼠傷寒沙門氏菌時，發現細胞中SAT 的濃度遠低于OASTL，后者大約是前者的300 倍，說明細胞中僅僅只有一小部分的OASTL和SAT 存在相互作用，形成了CSC。Wirtz 等［7］曾對CSC進行過缺失作圖和雙雜交實驗，以便更好地描述SAT-OASTL 復合體中結構域的特性，但到目前為止，這個復合體的晶體結構圖還沒有人能夠制作出來。另一方面，盡管OASTL 二聚體的三維結構圖已經被Nakako 等［8］繪制完成，但由于這個復合體的表面相互作用極其復雜，目前仍不清楚OASTL結構域中與SAT 產生相互作用的是哪部分序列，也就很難對其與SAT 產生相互作用的各個氨基酸殘基進行分析作圖［8］。迄今為止對這個復合體生物化學研究還僅能展現CSC 組裝形成過程中的局部視圖。

2 半胱氨酸合成酶復合體的組裝形成

之前的多個研究已經表明植物和細菌的OASTL和SAT 之間存在相互作用，但關于來自植物或細菌的CSC 的組裝結構的信息還很少，目前尚不清楚CSC 組裝形成的詳細分子基礎。Kredich等［3］使用超速離心機確定了從鼠傷寒沙門氏菌純化的CSC 的組合分子量為310，并提出它含有1個SAT 六聚體和2 個OASTL 二聚體。后來，體積排除色譜法研究揭示了植物CSC 具有相似的分子量，但提出了一個替代模型，其中同源四聚體SAT 和2 個OASTL 二聚體締合形成大分子組合。隨后，分別測定了來自細菌的SAT 和來自細菌和植物的OASTL［9］的X 射線晶體結構。細菌SAT 似乎可以看作同源六聚體（單體Mr≈30-33），其中2 個三聚體頭對頭排列，每個三聚體的C 末端尾部在六聚體的相對端（圖2a區域）。在植物和細菌中，OASTL被組裝為同型二聚體蛋白（單體Mr≈35-38），每個單體活性位點帶有含吡哆醛磷酸鹽分子的席夫堿，其中的賴氨酸殘基具有催化作用（圖2b區域）。嘗試鑒別SAT-OASTL 相互作用位點的研究表明，SAT 的C 末端對于復合物形成是至關重要的，且SAT 的C 端區域也是活性位點的位置。通過研究細菌和植物OASTL 對應于其同源SAT 的C 末端區域的肽復合位置的X 射線晶體結構，結果顯示OASTL 活性位點就是其與SAT 結合的位置［10］（圖2）。

在這一相互作用的過程中SAT 最大限度地結合2 個分子的OASTL，這被認為涉及將C 末端從SAT 三聚體中的原體對接到OASTL 活性位點。這種相互作用使OASTL 催化失活，并防止其進一步結合SAT 三聚體；因此，該系統顯示了接觸誘導可以導致每個生物大分子的一半失活。為了更好地了解CSC 形成的動力學和能量學，Ting Wang（2012）等［12］在平衡和預穩態下研究了OASTL 和SAT與大腸桿菌的相互作用。使用在CSC 形成反應的不同點引發CSC 解離的實驗策略，鑒定出3種穩定形式的復合物，確定了2 個瞬時存在的中間體，其中一個來自嗜血桿菌流感的CSC［13］。將SAT 與其C 末端肽的結合進行動力學和能量學比較，結果支持了SAT 的C 端通過將CSC 蛋白質復合物栓系在一起的非別構相互作用附著于OASTL的機制。松散耦合的復合物接下來參與了至少2次在能量上更有優勢的異構化，產生處于最佳穩定狀態的CSC 復合物并導致OASTL 的失活。

Julie A.Francois 等［14］更進一步確定了擬南芥OASTL（At-OASTL）的結晶結構，發現擬南芥OASTL與對應的SAT（C10 肽）的C 末端10 個殘基的肽結合。具體方式是與關鍵活性位點殘基（Thr-74，Ser-75 和Gln-147）的氫鍵相互作用，將C10 肽鎖定在結合位點。這種與C10 肽結合可以通過阻斷的方式獲得OASTL 催化殘留物，這說明了復合物的形成是如何下調OASTL 活性的。將擬南芥OASTL 與細菌OASTL 比較表明，活性位點的結構可塑性允許SAT C 末端與結構相似的OASTL 活性位點的不同序列結合?；钚晕稽c突變 （T74S，S75A，S75T 和Q147A）影響的量熱分析表明，這些殘基對于C10肽結合是重要的，并且在這些位置的變化破壞同源二聚體酶中活性位點之間的通信。

3 半胱氨酸合成酶復合體的調控機制

CSC的形成在調控這2 個酶的活性中起著重要的作用。由CSC 調節的硫同化和半胱氨酸生物合成之間的相互作用具有非常重要的意義，由于最終產物半胱氨酸是植物中所有含硫醇化合物的硫代謝來源，其合成代謝在硫醇代謝中具有中樞作用，并且可以影響多種細胞過程。Hell 等［15］提出了一個假說，闡明了復合體形成的重要意義，其要點在于：1）當細胞中有足夠的硫時，由于硫化物能使復合體穩定，所以OASTL 和SAT 結合。2）由于結合狀態下的OASTL 對OAS 的親和性很低，OAS 合成后就離開復合體。3）OAS 被游離的OASTL 消耗生成半胱氨酸，大約5%的OASTL 形成復合體，而95%處于游離狀態。在硫缺乏時硫化物的量下降，OAS 累積到足以有效解離SAT 和OASTL 復合體的濃度。4）結果SAT 活性降低（降解或被修飾），同時，OAS 誘導負責硫的吸收和同化的基因解除被抑制的狀態。5）這是個可逆的系統，因為進入細胞的硫酸鹽被還原后，硫化物被摻合進半胱氨酸，這步反應由游離的OASTL 催化，并利用了累積的OAS作為底物，這樣就降低了OAS 的水平，從而促進了復合體的形成。6）同時也可看到SAT（至少其胞質形式）的活性受到L-半胱氨酸反饋抑制。

這個假說對于闡明復合體形成及其對硫吸收途徑調節的影響有很大幫助。具有活性的OASTL并不在復合體當中，而是處于游離狀態，當其與SAT 形成復合體后，則通過變構效應而失去活性。有趣的是，SAT 只有在復合體當中才具有活性，而處于游離狀態時則沒有活性［16］。當細胞中的硫充足時，游離的OASTL 將OAS 轉化為半胱氨酸，并使半胱氨酸過量存在。大約有5%的OASTL 參與形成復合體，其他95%的OASTL 則處于游離狀態。最近獲得的動力學數據，為CSC 作為細胞中硫在初級代謝中流通調節開關的作用提供了證據［17］，同時也表明硫化物能誘導CSC 的形成，而OSA 則促使復合體解離。所以，在硫缺乏時，硫化物的量下降，OAS 就會累積到足以有效解離SAT 和OASTL 復合體的濃度，結果SAT 降解或被修飾，其活性就會降低。不但如此，OAS 誘導負責硫的吸收和同化的基因同時會解除被抑制的狀態。這個系統是可逆的，進入細胞的硫酸鹽被還原后，硫化物就進入了半胱氨酸，無機硫轉化成有機硫，游離的OASTL 在反應中以累積的OAS 作為底物進行催化反應，利用并消耗了OAS，使其水平降低，這又促進了OASTL 和SAT 的結合。同時，也可看到L-半胱氨酸對SAT（至少其胞質形式）的活性進行反饋抑制。

Sangaralingam 等［11］使用生物和物理方法的組合，研究了植物CSC 的組成，并提出了一種監管大分子裝配體系結構的新模型。穩態動力學分析表明，CSC 形成增強SAT 活性，并通過生物合成途徑的最終產物半胱氨酸從底物抑制和反饋抑制中釋放SAT。半胱氨酸分別抑制SAT 和CSC，表明OASTL 和SAT 的相互作用是負合作的，并且2 種酶的結合減輕了SAT 活性對半胱氨酸生成的反饋抑制。該研究小組根據以前的報告和他們的分析數據，建議將OASTL 看作SAT 的酶伴侶。

3.1 重組植物CSC 的調控作用 多酶復合物在包括翻譯、轉錄、基因表達和信號轉導等多種細胞過程中起核心作用。重組植物SAT 和OASTL 的生物化學分析表明，CSC 中蛋白質的可逆結合控制細胞硫穩態。SAT 和OASTLs 的轉錄本豐度，蛋白質水平和可提取活性未被硫同化途徑的硫限制或遺傳操作顯著改變。然而，接觸有毒化合物或苛刻脅迫處理可以誘導擬南芥中特定SAT 和OASTL同種型的顯著轉錄。這就提供了基于對自由存在的SAT 的動力學研究方法，其中SAT 活性主要通過SAT 的半胱氨酸反饋抑制在代謝水平上進行調節。隨后，Wirtz 等［18］提出了基于SAT 和OASTL在異寡聚半胱氨酸合成酶復合物中的可逆相互作用的SAT 活性的調節模型。

3.2 CSC 在亞細胞中的分布及線粒體CSC（mCSC）的調控 CSC 雖然同時存在于植物細胞的細胞溶質、質體和線粒體中，但SAT 和OASTL 的活性和量在這些亞細胞間隔之間有顯著的差異。在擬南芥葉中，OASTL 活性的90%由OASTLA 在胞質溶膠中提供，OASTLB 在葉綠體中提供，其余活性來自線粒體OASTL C［19］。相比之下，發現總SAT 活性的80%來源于線粒體同工型SAT3（serat2；2）。殘留SAT 活性由質體局部化的SAT1（serat2；1）和3 個胞質SAT，其中SAT5（serat1；1）是最豐富的。每個SAT 基因的T-DNA 插入突變體是可行的，證明在細胞溶質、質體或線粒體中單獨的OAS 合成不是必需的。線粒體SAT3 的敲除引起顯著的生長遲緩，這表明線粒體在供應OAS 用于半胱氨酸合成中的主要作用。mCSC 在調節SAT3 活性和細胞半胱氨酸中的突出作用也由oastl-C 的生長遲緩表型展現出來，而oastl-A 和oastl-B 突變體則不受影響。然而，體外CSC 形成對絲氨酸和乙酰輔酶A 的SAT3 親和力影響不大，但與游離SAT3 相比，CSC 結合的SAT3 對半胱氨酸的反饋抑制敏感性較低。

3.3 CSC 對細胞內代謝調節的影響 在代謝方面，OASTL 以多種方式作為SAT 的酶伴侶。不僅CSC 的形成增加了OAS 合成速率，SAT 和OASTL的關聯將半胱氨酸生物合成的限制步驟從反饋抑制中釋放出來。植物中的生理半胱氨酸水平范圍為10～20 μm。CSC 的快速和穩定的形成將允許在高需求條件例如環境氧化應激下產生OAS 以維持細胞內半胱氨酸水平。在低硫狀態條件下，復合物的解離通過反饋調節恢復SAT 的調節。有趣的是，CSC 的形成也可能增加SAT 的物理穩定性。在大腸桿菌中，與OASTL 的結合可防止SAT 的冷滅活。不清楚這是否也發生在諸如大豆之類的植物中，其中硫同化和半胱氨酸生產在低溫冷卻時需求會增加［20］。最終，植物中的半胱氨酸生物合成和硫醇代謝在蛋白質水平上通過多種分子機制（包括復合物形成，氧化還原調節和磷酸化）被高度調節，以整合調節酶活性的多種細胞信號以滿足代謝物供應的各種需求。