硅膠柱層析分離天然產物實驗要點分析

劉延杰 陳彎彎 向碧云 朱旭東 郝曉冉

（北京師范大學生命科學學院 北京 100875）

從天然產物中提取、分離和表征生物小分子，是新藥研發中獲得先導化合物的主要途徑之一。層析法（Chromatography）是天然產物分離最常用的方法之一。層析法最早是根據化合物顏色分離一些植物色素，如今，層析法已經演變成為一種高度敏感的、有效的化合物分離和鑒定方法［1-8］。柱層析一般包括常壓柱層析、中壓柱層析和高壓柱層析。按照柱填料又可分為硅膠柱層析（Silica gel column chromatography）、離子交換層析（Ionexchange chromatography，IEC）、凝膠滲透色譜（Gel-permeation /molecular sieve chromatography，GPC）、疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）等［9］，其中以硅膠柱層析（正／反相）使用最為廣泛。與其他層析方法相比，柱層析具有操作簡單，經濟實惠，樣品承載量大等優點，是天然產物分離純化的首選方法之一［10-12］。

硅膠柱層析分為正相硅膠柱層析和反向硅膠柱層析2 種，正相硅膠柱層析填料為正相硅膠，適合分離相對極性較小的化合物，例如各類苷元；所以通常選用極性較小的有機溶劑作為洗脫劑，例如石油醚-二氯甲烷洗脫系統，氯仿-乙酸乙酯洗脫系統等。反向硅膠柱層析使用的是反相硅膠，適合分離極性相對較大的化合物，例如生物堿等各類苷類，常采用甲醇-水，乙腈-水不同比例作為洗脫劑。

硅膠柱層析在上樣時，常分為干法上樣和濕法上樣。干法上樣將待分離物質溶解后拌在少量硅膠G 中，待揮發至干后填入裝好的硅膠柱中，再加層析液進行洗脫。濕法上樣先將硅膠G 用洗脫液溶脹后裝入硅膠柱，再將溶解好的樣品倒入硅膠柱進行分離。這2 種方法對物質分離效果差別不大，濕法上樣操作簡單便捷，但溶解樣品最好用二氯甲烷、乙酸乙酯等極性較小的溶劑，對于一些溶解度小的物質，宜使用干法上樣。本文以常壓正相硅膠柱的干法上樣為例，對小孢擬盤多毛孢紅薯渣發酵產物二氯甲烷粗提物進行初步分離。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 二氯甲烷相粗提物約1 g；100～200 目硅膠G 約100 g （青島海洋化工廠分廠）；內徑×柱高=2.5 cm×40 cm 玻璃柱；Si60 F254 TLC 薄層層析板（默克化工技術有限公司）；0.3 mm 毛細管。10%硫酸乙醇顯色液；二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇（分析級，北京藍弋化工產品有限責任公司）。

1.2 層析液比例確定 由于TLC 法操作簡單，且層析原理與硅膠柱層析一致，所以確定硅膠柱層析層析條件時一般用TLC 探索條件。TLC 法分為正相TLC 和反向TLC 2 種。由于硅膠柱層析可以近似地看作TLC 板多次展開系統，樣品洗脫速率要比TLC 板上展開速率快，所以一般選用Rf值為0.3～0.5 的層析液進行硅膠柱層析。

具體操作方法如下：

1）用玻璃刀將現成的TLC 板裁成2 cm×8 cm左右小板，用毛細管將稀釋后適當濃度的粗提物樣品點在離TLC 板短邊緣1 cm 處正中央。注意樣品點盡可能小，可及時用吹風機冷風吹干。

2）選擇二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶0，9∶1，1∶1 和0∶1 對樣品進行TLC 展開，待層析液跑至上邊緣0.5 cm 處停止展開，用吹風機吹干硅膠板上的有機試劑。

3）將展開好的TLC 板用硫酸乙醇液顯色后觀察（圖1），目標物質的Rf 值分別為0.15，0.5，0.8和0.9，選取Rf=0.3-0.5 的層析液作為硅膠柱層析的層析液，所以選擇二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1 為柱層析層析液。

若不確定待分離樣品極性，可按照有機溶劑極表從小到大依次嘗試摸索極性。常用的溶劑極性從小到大依次為： 石油醚＜環己烷＜苯＜二氯甲烷＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。選擇層析液極性越大，樣品點越接近溶劑前沿；極性越小，樣品點越接近原點。單一溶劑一般達不到層析要求，通常選擇2 種或3 種溶劑混合使用，還要考慮到溶劑間的溶解度問題。常見的混合溶劑組合有：石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，二氯甲烷/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇，乙酸乙酯/甲醇等。

1.3 拌樣 拌樣是硅膠柱層析干法上樣的一個重要環節。拌樣所用的硅膠G 的量要合適，一般以樣品質量∶硅膠G 質量=1∶3 為宜。若硅膠G 過多，則柱層析樣品層過厚，各個組分容易發生交錯重疊；若硅膠G 過少，則樣品不能完全吸附在硅膠G 中，使樣品損失嚴重。此外，拌樣不均勻也是影響實驗結果的重要因素。

具體方法如下：

1）稱取1 g 粗提物，按照粗提物質量∶硅膠G質量=1∶3 稱取3 g 硅膠G 于蒸發皿中。

2）將樣品用有機試劑完全溶解，在通風廚中吸取少量樣品滴加到硅膠G 中，用藥勺將樣品攪拌均勻，待樣品揮發至干后繼續滴加樣品，直至將樣品全部拌入硅膠G 中。期間不斷用藥勺攪拌硅膠G 防止拌樣不均勻。

3）將揮發干的硅膠G 在通風廚中放置過夜，使有機試劑完全揮發。

1.4 裝柱 裝柱是硅膠柱層析最重要的環節，柱子質量直接決定樣品的分離效果和得率。首先，保證柱身豎直，否則洗脫時樣品條帶會呈傾斜，嚴重時洗脫產物不純，需要重新純化。其次，硅膠G 要壓實，不能留有氣泡，否則樣品條帶會呈彌散型，影響分離效果。具體步驟如下：

1）將玻璃柱豎直架于鐵架臺上。

2）按照質量比樣品∶硅膠G=1∶40 稱取硅膠G 40 g。將硅膠G 倒入硅膠柱內，拍打柱身使硅膠粉壓實，期間不斷旋轉柱體，使硅膠G 填充均勻。

3）將拌好樣的硅膠G 倒入硅膠柱內，同樣拍打柱身并不斷旋轉柱體，使樣品層均勻。

4）在樣品層上鋪一層約0.5 cm 厚的硅膠G，防止加層析液時樣品層飛濺。

1.5 樣品接收 配制3 倍柱體積的層析液，超聲10 min。打開玻璃柱閥門，緩慢將層析液傾倒入硅膠柱內至滿。選擇合適大小的試管接收流出液，一般10～20 mL/管為宜，流速1 mL/min，過快樣品拖尾嚴重，過慢則樣品條帶彌散。

如果目標產物與雜質極性相差不大，可以采用梯度層析系統。梯度層析又稱梯度洗脫，是指用不同極性洗脫劑分別對樣品進行洗脫，達到分離的效果。正相硅膠柱層析如需要梯度層析，則按照層析液極性由小到大依次倒入物質硅膠柱內。注意層析液極性差別不應過大，且換層析液極性前，盡可能將硅膠上方的層析液流盡。

1.6 檢測與合并 以20 mL/管收集流出液，共收集10 管，分別對這10 管流出液進行TLC 檢測，展開劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1（圖3）。合并1～4 管，5～7 管，8～10 管，旋蒸至干計算樣品質量，分別為7 mg，10 mg 和4 mg。分別轉移至EP管中，編號樣品1、2、3，-20℃保存。

合并時如果樣品量足夠，為了保證純度，可以棄去純度不高的接收液；如果樣品量少，不足以進行之后的產物鑒定實驗，要將所有含有目標物質的接收液合并，并進一步純化。

2 硅膠柱層析注意事項及常見問題解決

1）檢查硅膠柱閥門是否泄漏。一是玻璃柱使用前，首先檢查氣密性，保證閥門完好不漏液；二是將硅膠G 裝入硅膠柱后，先打開硅膠柱閥門檢查是否有硅膠漏出，并不斷拍打柱身，使硅膠柱裝填均勻。三是在洗脫過程中關注閥門處是否有液體滲出。

2）在用洗脫液進行洗脫時，防止洗脫液流干。硅膠柱層析是一個持續洗脫的過程，期間應該保證樣品一直處于洗脫狀態。如果洗脫液流干后再補加洗脫液，則會在柱子中殘留氣泡影響分離效果。

3）硅膠柱出現裂縫。層析液流干或者裝柱時硅膠G 不均勻都可能造成硅膠柱出現裂縫。如果目標物質已被沖到裂縫下方，對分離效果影響較小，可以繼續用洗脫液洗脫；如果裂縫較大，嚴重影響分離效果，可用甲醇將所有樣品全部沖下，蒸發濃縮后再次柱層析。

4）回收產物成分仍然很復雜。如果各個組分之間極性差別較大，可能是洗脫液極性偏大，可以適當減小洗脫液極性或者選擇10 mL/管或者更小體積接收洗脫液；如果各組分之間極性差別較小，可以通過適當降低流速改善，也可以選擇制備成硅膠板或者葡聚糖凝膠柱等其他純化方式進一步純化。

3 結論

常壓硅膠柱層析操作簡單、廉價，且載樣量大，因而常用于分離純化天然產物。本文以1 g 粗品的開放性硅膠柱分離為例，通過干法上樣，TLC檢測后合并流出液，將3 種不同物質初步分離。實驗結果顯示，通過開放性硅膠柱層析能夠很好地將極性不同的物質分離。工業上一般應用多次硅膠柱層析純化，或者將硅膠柱層析與分子篩、離子交換層析等其他分離純化方法結合，以取得更好的純化效果。