硫化物對櫛孔扇貝線粒體的損傷研究*

關 楊 王宇翔 畢愿坤 葛 順 張立濤

（濟寧醫學院生物科學學院 山東日照 276826）

硫化物是含有-2 價硫離子化合物的統稱，在水環境中通常以H2S、HS-和S2-3 種形式存在，可互相轉化［1］。雖然近20年來研究發現一定濃度硫化物在動物體內神經調節，血管張力調節及生成，氧化應激細胞的保護和抗炎癥等方面發揮著重要作用［2］，但是由于其可以與線粒體中的復合體Ⅳ即細胞色素c 氧化酶中aa3 亞基中的血紅素卟啉環鐵離子可逆性地結合，進而阻止氧氣與其結合，中斷線粒體呼吸鏈的電子傳遞，導致ATP 的耗盡和乳酸的積累，因而對生物體產生毒害［3］。在水產養殖過程中，硫化物主要通過硫酸鹽的異化還原過程及有機質被微生物分解產生［4］，對水產養殖生物具有很強的毒性，其毒性研究主要集中在對蝦類生物中［5-7］，但是對于貝類生物中涉獵很少。本研究以我國北方主要養殖貝類櫛孔扇貝作為研究對象，通過測定硫化物暴露下櫛孔扇貝各組織的線粒體活力、膜腫脹度、線粒體超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）含量，進而確定硫化物對其線粒體的損傷，為深入了解硫化物暴露對扇貝線粒體的影響提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及硫化物應激處理

1）實驗動物。櫛孔扇貝于2016年4月購買于日照市秦樓水產市場，產地為日照近海潮間帶。實驗室通氣暫養1 周（暫養水溫度18℃，pH7.9，鹽度30）后，選擇活力旺盛、大小相近的個體進行硫化物處理。

2）材料處理。在含有過濾海水的封閉大燒杯內采用1.7 mg/L 硫化物處理櫛孔扇貝，6 h 后對櫛孔扇貝的組織（外套膜、貝殼肌和肝胰腺）取樣。

1.2 實驗方法

1）線粒體提取。剪取櫛孔扇貝各組織，濾紙吸干水分后稱重（0.7 g 以上），4℃條件下采用差速離心法制備線粒體［8］。

2）線粒體活力測定。取新鮮制備的線粒體懸液100 μL，加入酶標板微孔中，加入40 μL 四甲基偶氮唑鹽（5 g/L），30℃繼續孵育30 min，再加入100 μL 異丙醇20 min 后在酶標儀570 nm 測定吸光度，OD570值大小表示線粒體活力。

3）線粒體膜腫脹度測定。在4℃放置的反應緩沖液（250 mmol/L 蔗糖、5 mmol/L KH2PO4、3 mmol/L琥珀酸鈉、pH7.2）中加入線粒體懸液，調整線粒體蛋白含量為0.5 mg/mL，分光光度計540 nm 處測定吸光度（OD540），反應條件保持25℃恒溫［9］。

4）線粒體超氧化物歧化酶（SOD）的活性測定。設置空白管和自氧化管，各加入4.5 mL Tris-HCl（50 mmol/L）。自氧化管再加入10 μL 鄰苯三酚（50 mmol/L），迅速搖勻，立即倒入1 cm 比色杯中，以空白管調零，在325 nm 波長處測定吸光度（A）值，每隔30 s 讀數一次，測定4 min 內每分鐘吸光度（A）的變化A=A/min。隨后樣品管取代自氧化管，樣品管內先加入10 μL 線粒體懸液，再加入10 μL 鄰苯三酚。其余步驟與鄰苯三酚自氧化速率的測定相同［10］，其計算公式如下：

5）線粒體丙二醛(MDA)含量測定。采用丙二醛測定試劑盒（南京建成）測定線粒體中MDA 的含量，測定單位表示為nmol/mg.prot。

6）數據處理。所有數據結果均以平均值±標準誤的形式表示，在SPSS 18.0 統計分析軟件中利用t 檢驗進行組間比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 硫化物對線粒體活力的影響 活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的四甲基偶氮唑鹽還原為難溶于水的紫色結晶物，酸性異丙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）或二甲亞砜（DMSO）均能溶解細胞中的藍紫色結晶物，溶液顏色的深淺與所含的量成正比，因此可根據570 nm 測定的吸光度大小間接反映線粒體活力。結果如圖1所示，在對照組中，肝胰腺、外套膜和貝殼肌的OD570分別為0.83、0.69 和0.64；硫化物處理組線粒體活力分別下降了17.5%，36.2%和31.3%，均與對照組相比存在顯著性差異（P＜0.05）。外套膜和貝殼肌能夠與海水中的硫化物直接接觸，因此降幅較大，均超過了30%，而肝胰腺位于扇貝內部，降幅較少。但綜合來說，硫化物可以顯著降低線粒體的活性。

2.2 硫化物對線粒體腫脹度的影響 線粒體膜上存在通透行轉運孔道（PTP），其開放會導致線粒體內膜通透性增加，使線粒體基質呈現高滲狀態，水滲透內流進而導致線粒體膨脹。因此可通過線粒體的腫脹程度推測PTP 的開關情況，結果如圖2所示，在硫化物處理組中，3 個組織的線粒體在540 nm 的吸光值均顯著性地降低了40%以上（P＜0.05），表明線粒體腫脹度變大，暗示線粒體通透性轉變孔道開放明顯。線粒體通透性轉運孔道開放常常伴隨ATP 耗竭、線粒體膜去極化、溶酶體破壞等，也可能導致細胞色素C 釋放，從而對生物體造成損傷［11］。

2.3 硫化物對線粒體SOD 的影響 SOD 是生物體內最重要的抗氧化酶，其最主要的功能是去除體內產生的氧自由基。線粒體是氧自由基產生的重要部位，對其內部SOD 活性的測定可有效評估其體內氧自由基的活性。SOD 的酶活測定結果如圖3所示，肝胰腺、外套膜和貝殼肌中SOD 的酶活分別達到23.8 U/mg.prot、19.9 U/mg.prot 和22.7 U/mg.prot，而在硫化物組SOD 酶活分別降到18.8 U/mg.prot、16.3 U/mg.prot、13.7 U/mg.prot，與對照組相比出現了顯著性的差異（P＜0.05），該結果顯示線粒體中氧化與抗氧化動態平衡可能被打破，導致活性氧不能被有效地清除，從而使線粒體產生不可逆轉的氧化損傷［12］。

2.4 硫化物對線粒體MDA 含量的影響 MDA是脂質過氧化的最終產物，其含量越高表明脂質過氧化的程度越強，生物膜的損傷程度就越大。研究結果（圖4）顯示在硫化物處理組中，肝胰腺、外套膜和貝殼肌中分別達到了2.26 nmol/mg.prot、2.64 nmol/mg.prot 和2.55 nmol/mg.prot，遠 遠 高 于對照組，存在顯著性差異（P＜0.05）。丙二醛含量的增加可能會導致線粒體DNA 的損傷［13］，破壞線粒體膜結構［14］從而對線粒體造成不可逆轉的傷害。

3 結論

櫛孔扇貝經1.7 mg/L 硫化物暴露，各組織線粒體的通透性轉變孔道開放明顯，腫脹度增大；SOD 酶活降低，線粒體產生的活性氧不能有效清除；MDA 含量增加，影響線粒體的膜結構；線粒體結構產生損傷，線粒體活力顯著降低。