植物WRKY轉錄因子的研究進展

梁 濱 董 冬

（山東省濱州市鄒平縣魏橋中學 山東濱州 256212）

植物在生長過程中會受到生物逆境（病原菌侵入、病蟲害等）和非生物逆境（高溫、高鹽、干旱等）的脅迫（圖1），從而抑制植物的生長發(fā)育，造成各種作物質量、產(chǎn)量的下降，給人類生產(chǎn)帶來極大危害。在長期進化過程中，植物為了適應這些不利的環(huán)境因素，在體內形成了一套既復雜且又高效的植物防衛(wèi)反應機制。當植物受到逆境脅迫時，胞外的信號（高溫、高鹽、干旱、病原菌等）通過一系列信號轉導途徑（例如通過MAPK 激酶等進行信號轉導）級聯(lián)放大進入細胞核內，通過與其他防御相關蛋白之間的相互作用，進而激活或抑制下游相關防御基因的轉錄，從而響應植物對相關逆境脅迫的應答反應［1］。其中，轉錄因子（MYC、NAC、WRKY、ERF、bZIP 等）在這一系列調控中起到非常重要的作用［2］。在這一系列的轉錄因子中，WRKY是近年研究比較廣泛的一類轉錄因子，研究表明，WRKY 在植物生長發(fā)育和防衛(wèi)反應機制中起重要調控作用。

轉錄因子WRKY 是近年在植物中新發(fā)現(xiàn)的一類超大家族的轉錄調控因子［2］，已發(fā)現(xiàn)的WRKY轉錄因子，在擬南芥、水稻等作物中參與免疫反應調節(jié)的WRKY 家族成員既有起正調節(jié)作用的，也有起負調節(jié)作用的，但二者的N-末端均含有高度保守的WRKYGQK 氨基酸序列［3］。不同的WRKY家族成員均通過核心結構域（WRKYGQK）結合靶基因啟動子區(qū)域保守的W-BOX 調控基因轉錄表達，由此產(chǎn)生的一個突出問題是： 不同的WRKY家族成員如何實現(xiàn)其在植物應答逆境過程中的特異功能？最近大量報道表明，除W-BOX 側翼序列能在一定程度上影響WRKY 蛋白特異調節(jié)靶基因外，還能與其他蛋白的互作并調節(jié)其功能以實現(xiàn)功能的特異性。該家族的WRKY 基因分別相繼從甜馬鈴薯、野燕麥、皺葉歐芹、擬南芥等植物中分離獲得。同時，諸多專家也研究了其相應的分子生物學功能，目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)WRKY 基因74 個，玉米中發(fā)現(xiàn)119 個，水稻中發(fā)現(xiàn)105 個，油菜中發(fā)現(xiàn)46 個。這些研究都表明了WRKY 轉錄因子確實參與植物的多種逆境脅迫的應答，同時還參與植物生長的重要生理生化活動的調控［4-6］，在植物抗逆反應過程中具有重要的作用（圖2）。

1 WRKY 轉錄因子結構特征及分類

WRKY 轉錄因子是植物中廣泛存在的一類超基因家族，通過其保守的氨基酸序列（WRKYGQK）對靶基因啟動子區(qū)域的W-box［（T）TGACC（AT）］特異識別，并調控靶基因的轉錄表達。WRKY 家族在代謝調控、種子的萌發(fā)及發(fā)育衰老調控、植物防御應答、形態(tài)學建成等生命過程中都起到重要作用。

WRKY 是鋅指結構的轉錄因子，它的DNA 結合區(qū)通常包含1 個或2 個保守的WRKY 核心結構域，根據(jù)其DNA 結合區(qū)的核心結構域的個數(shù)及鋅指結構類型將WRKY 轉錄因子分為三大類：第1 類具有2 個WRKY 核心結構域及Cys2His2 型鋅指結構；第2 類具有1 個WRKY 核心結構域及Cys2His2 型鋅指結構；第3 類具有1 個WRKY 核心結構域及Cys2HisCys 型鋅指結構。WRKY 轉錄因子是植物中最大的轉錄調節(jié)子家族之一（擬南芥中有74 個成員，水稻中100 多個成員，辣椒中有報道的也已經(jīng)有40 多個），它能與各種蛋白質相互作用，包括MAP 激酶，MAP 激酶的激酶，14-3-3 蛋白，鈣調蛋白，組蛋白去乙酰化酶，抗性蛋白和其他WRKY 轉錄因子，構成完整的信號網(wǎng)路調節(jié)許多植物生理過程。

植物有2 套固有的可誘導的免疫機制： 病原菌相關分子模式觸發(fā)的免疫機制（PTI）及效應子觸發(fā)的免疫機制（ETI）［2］，而WRKY 轉錄因子在這2 種免疫機制中都起重要作用。擬南芥中AtWRKY48和AtWRKY7 在抗丁香假單孢桿菌中分別起正調節(jié)和負調節(jié)作用；AtWRKY51，AtWRKY70 在JA，SA，ET信號通路中起作用；AtWRKY25，AtWRKY40，AtWRKY28，AtWRKY70 同時受到生物及非生物脅迫的調控。同時WRKY 也受到機械損傷的誘導，例如煙草的NtWRKY6，NtWRKY3，參與糖代謝，以及對低溫、干旱脅迫的應答。關于辣椒WRKY家族的研究還很不深入，到2014年NCBI 才公布了11 條辣椒WRKY 基因序列。

擬南芥中AtWRKY58 作為NPR1（獲得性防御系統(tǒng)SAR 的一個負調節(jié)子）的下游基因參與NPR1 基因介導的信號傳遞。CaWRKY58 在辣椒對病原菌的防御反應過程中起到轉錄負調節(jié)作用，青枯病侵染的辣椒中，CaWRKY58 的表達先出現(xiàn)先下調后上調的情況，而且CaWRKY58 的表達被茉莉酸和脫落酸所抑制，同時將CaWRKY58 轉化煙草，使煙草在病原菌侵染下表現(xiàn)出更嚴重的病狀，同時在轉化CaWRKY58 的煙草中很多重要的過敏反應相關的標記基因及一些防御相關的標記基因都出現(xiàn)下調，而且CaWRKY58 基因沉默后的辣椒植株表現(xiàn)出對病原菌的更耐受性及各種防御相關基因的上調。WRKY58 的作用可能是提供一個保障機制，以防止防衛(wèi)反應的激活停留在高SA 水平。

WRKY 轉錄因子的結構含有DNA 結合區(qū)域、核定位信號區(qū)、轉錄調控區(qū)域和寡聚化位點［7］。結構特點是其DNA 結合區(qū)域中都至少含有一個WRKY 結構域，該結構域的N-末端含有高度保守的WRKYGQK 氨基酸殘基和CX4-5CX22-23HXH 型或CX7CX23HXC 型的C-末端鋅指結構。根據(jù)WRKY 的結構特征，可分為3 種類型：Ⅰ類為WRKY 轉錄因子含有2 個WRKY 結構域，鋅指結構類型為C2H2（CX4-5CX22-23HX1H），其DNA 結合功能主要是通過C-末端的WRKY 結構域介導；Ⅱ類為WRKY轉錄因子只含1 個WRKY 結構域，鋅指結構類型也為C2H2（CX4-5CX22-23HX1H），而且大部分高等植物WRKY 轉錄因子是屬于這類型；Ⅲ類為WRKY 轉錄因子也僅含1 個WRKY 結構域，鋅指結構為C2HC （CX7CX23HX1C），但這類型轉錄因子一般只存在高等植物中，在一些低等植物中是不存在的。

2 WRKY 蛋 白與W-box 結合

眾多研究表明:WRKY 轉錄因子能特異結合啟動子上的順式作用元件W-box［（T）（T）TGAC(C/T)］,其中高度保守序列TGAC 對于WRKY 的結合功能是必要的，任一核苷酸被替代，與之結合的能力都大幅度下降甚至可能完全消失。研究還發(fā)現(xiàn)WRKY 轉錄因子不僅與自身基因啟動子上的順式作用元件W-box 結合，而且與大量抗病相關基因啟動子的W-box 結合參與表達調控［8］，且這些W-box 多存在于抗病等相關基因的啟動子區(qū)域，說明WRKY 轉錄因子參與植物的抗逆反應及其生長過程中生理生化等的調控。為了進一步研究W-box 順式作用元件在基因表達調控中的作用，通常利用人工合成只含W-box 順式作用元件的啟動子研究其在植物中的防御反應［9］，結果表明僅含W-box 的啟動子也能介導植物的逆境脅迫和防衛(wèi)反應。

3 WRKY 轉錄因子的生物學功能

3.1 參與生物逆境脅迫 目前大量報道表明，WRKY 轉錄因子在生物脅迫中的作用方面的研究既廣泛又深入。植物免疫系統(tǒng)包括PTI （PAMPtriggered immunity），ETI （Effector- triggered immunity），MTI（MAMP-triggered immunity）及SAR（Systemic acquired resistance）等多種免疫系統(tǒng)，WRKY基因在其中發(fā)揮著正調控或負調控的作用，而且在參與植物的抗病反應，既存在正調控調節(jié)又有負調控途徑［10］。

研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的大部分WRKY 基因受SA（水楊酸）和病原菌的誘導，并且這些WRKY 基因自身的啟動子中富含W-box，說明這類轉錄因子在植物抗病反應中形成一個復雜的調控網(wǎng)絡。很多WRKY 轉錄因子被報道能調控抗病基因（PR）的表達。擬南芥AtWRKY70 在SA（水楊酸）和JA（茉莉酸）途徑中扮演了重要的調控角色，其功能的缺失將使植物易感染灰霉病菌、葉斑病菌和真菌性白粉病菌等［11］。擬南芥AtWRKY18，AtWRKY40和AtWRKY60 結構非常相似，參與植物抗病并且在功能上存在冗余［12］，此外，AtWRKY18 還作為正調控因子參與系統(tǒng)獲得性抗性，而AtWRKY40沒有參與其中［13］。

另一方面，也有許多WRKY 基因參與植物防御的負調控。在擬南芥中，AtWRKY7 功能缺失體將導致細菌性葉斑病菌抗性的增強，且在AtWRKY7 和AtWRKY11 雙突變中得到進一步的提高，說明兩者在抗病過程中起到負調控作用［14］。AtWRKY25，AtWRKY38 和AtWRKY62 在植物防御中也起到負調控作用，其過表達植株都顯著抑制 了PR 基因的表達［15-16］。

此外，還有許多非模式植物中WRKY 基因參與了抗病反應，如皺葉歐芹中PcWRKY1，2，3，4，5，紅辣椒中CaWRKY1，40，大麥中的HvWRKY1，2，10，19，28 等都在抗病調控方面起到重要的作用。

3.2 參與非生物逆境脅迫 近年越來越多的研究證實了WRKY 基因在高溫、高鹽、機械損傷、干旱等非生物逆境脅迫下，其表達量會發(fā)生特異地變化，表明其在非生物逆境中扮演重要的角色，對于了解植物適應復雜多變的環(huán)境的分子機制具有重要的指導意義。qRT-PCR 研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtWRKY25，28，40，70 均受到高鹽、高溫及滲透脅迫的誘導［17］，AtWRKY25，26，33，39 則能應答熱激反 應［18-19］，AtWRKY57 能通過激活與ABA 相關基因的表達增強擬南芥耐干旱的能力［20］。此外還發(fā)現(xiàn)擬南芥AtWRKY7 中含有一個鈣調節(jié)蛋白結合域，能特異結合鈣調蛋白并介導Ca2+離子信號轉導［21］。這些研究有力地說明了WRKY 轉錄因子在抵御高溫、高鹽、干旱和熱等復雜環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用。

3.3 參與植物的生長發(fā)育及物質代謝 研究表明，WRKY 家族還參與了調控植物種子形成、休眠和萌發(fā)及葉片衰老等生長發(fā)育及物質代謝等一系列生理活動。例如擬南芥AtWRKY10 參與種子的發(fā)育過程，AtWRKY6 不僅參與植物的防御應答而且還參與植物的衰老調控，擬南芥AtWRKY44 參與調控種皮和表毛皮的發(fā)育，其功能突變體后使得表毛皮出現(xiàn)未分支且數(shù)量顯著下降，同樣地，水稻OsWRKY78 也參與調控種子大小［5］。此外，棉花GaWRKY1 參與調控棉子酚的合成。這些結果都表明WRKY 基因在植物生長發(fā)育、物質代謝等生理過程中發(fā)揮了極其重要的作用。

4 展望

其實，在應用基因工程培育作物抗逆新品種方面，人們已經(jīng)從植物基因組的角度進行了深入的研究，這些研究成果在分子水平上對植物的相關表達調控機制的研究具有重要的指導意義。而啟動子是基因表達調控的重要元件，是基因在轉錄水平的表達模式及調控機制中的一個關鍵元素。因此，研究WRKY 轉錄因子等相關抗病基因啟動子的調控特性，分離并分析其順式作用元件的分布及逆境應答對于闡明植物抗病性極其重要，可為作物抗病育種開辟出一條新途徑。大量報道表明，除了W-BOX 側翼序列能在一定程度上影響WRKY 蛋白特異調節(jié)靶基因外，還能與其他蛋白的互作并調節(jié)其功能以實現(xiàn)功能的特異性。而迄今僅分離鑒定了部分的WRKY 蛋白的互作蛋白，大多數(shù)WRKY 家族成員的互作蛋白仍未見報道。因此，分離相關的互作蛋白，同時對其互作驗證及功能和作用機制的研究將成為今后的研究熱點。