柴胡疏肝散對功能性消化不良大鼠內質網應激相關分子IRE1和TRAF2表達的影響

徐 寬，凌江紅,2，周 洲，張麗敏，張鈺琴，謝天一，王煜姣

功能性消化不良( functional dyspepsia,FD)包括餐后飽脹不適、早飽、上腹痛或上腹部燒灼感等癥狀, 是指發生在胃和十二指腸沒有任何系統性、代謝性和器質性疾病的一種或多種消化不良癥狀[1]。臨床上關于FD的治療還沒有有效方法，對FD的防治成為亟待解決的課題。內質網應激可以通過處理內質網中未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的堆積來維持細胞的正常功能，是內質網中的自我代償過程[2]。疾病的發生發展與內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有密切關系，通過調節ERS來防治疾病已成為研究熱點。柴胡疏肝散源自《景岳全書》，是疏肝理氣法的代表方劑。本課題組既往研究[3- 4]顯示柴胡疏肝散能夠改善FD大鼠的胃動力，其機制可能與增強細胞活性和減少自噬有關，但是對于FD大鼠改善胃動力的深層機制尚不清楚。本研究從調控ERS角度來進一步探討柴胡疏肝散防治FD的機制，通過觀察ERS相關因子的變化，為柴胡疏肝散防治FD提供更深入的實驗依據。

1 材料

1.1動物SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體質量(250±20) g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。實驗前適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為正常組、模型組、生理鹽水組、柴胡疏肝散組及多潘立酮組，每組6只。SPF級環境飼養，溫度(22±3)℃，濕度50%，明暗交替12 h。

1.2藥物柴胡疏肝散(組成: 柴胡6 g, 陳皮6 g, 香附4.5 g, 川芎4.5 g, 枳殼4.5 g, 白芍4.5 g, 甘草1.5 g)及多潘立酮(10 mg/片, 西安楊森制藥有限公司生產, 批準文號:150324778)均購于廣西醫科大學第一附屬醫院藥房。柴胡疏肝散濃度參考徐叔云等主編的《藥理實驗方法學》第三版[5]，按照普通成人(60 kg/人)臨床用量的3倍，以1 ∶5的容積比用蒸餾水泡30 min，煎煮2 次(30 min/次)，過濾，去渣取汁，合并濾液加熱蒸發，制成0.32 g/ml水煎濃縮液，4 ℃保存備用；多潘立酮按成人(60 kg/人)臨床用量的3倍，用蒸餾水制成濃度為0.30 mg/ml。

1.3營養性半固體糊的制備羧甲基纖維素2.5 g，溶于62.5 ml 蒸餾水中，分別加入4 g奶粉、2 g糖、2 g淀粉，攪拌均勻，配制成73 ml 的營養半固體糊。4 ℃保存備用，用時恢復至室溫。

1.4試劑內質網應激因子肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)一抗、腫瘤壞死因子受體相關因子2(TNF receptor associated factor 2,TRAF2)一抗均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記二抗、濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RNAiso Pius、SYBR Premix試劑盒購自TaKaRa公司；逆轉錄試劑盒購自Thermo公司；引物設計合成由上海生物工程有限公司負責。IRE1上游引物：5′-GAC CGG CAG TTG CAG TAC AT-3′,下游引物：5′-TGG TCT GAT GAA GCA AGG TG-3′，擴增長度為118 bp;TRAF2上游引物：5′-GGC TTC TCC AAG ACC CTT CT-3′,下游引物5′-CAG GCA GAA GGA GCA GTA GC-3′，擴增長度為123 bp；GAPDH上游引物：5′-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3′，下游引物：5′-ATG GTG GTG AAG GCG CCA GTA-3′，擴增長度為143 bp。

1.5儀器實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，普通PCR擴增儀(美國Bio-rad公司)，超微量樣本分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，正置熒光相差微成像顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，凝膠成像分析儀(美國Bio-rad公司)。

1.6方法

1.6.1動物模型制備 30只SD大鼠，隨機分為正常組、模型組、生理鹽水組、柴胡疏肝散組及多潘立酮組，每組6只，雌雄各半，每6只一籠。參照改良夾尾刺激法[6]制造FD大鼠模型，即用紗布包裹止血鉗輕度鉗夾大鼠尾部中后1/3處，立即放開，每次30 min，2 次/d，持續4周。除正常組、模型組外，其余各組于造模同一天分別給予0.9% NaCl、柴胡疏肝散煎劑及多潘立酮灌胃，1.5 ml/100 g，早晚各1次，間隔12 h，連續給藥4周。

1.6.2標本收集 在實驗第28天各組大鼠禁食不禁水24 h，第29天各組大鼠予以半固體糊灌胃，30 min后將大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉，剖腹，結扎賁門和幽門。迅速剪取全胃，用濾紙拭干，稱取重量為全胃重量，沿胃大彎剪開胃體，觀察胃殘留食物情況及黏膜表面有無腫脹、潮紅、糜爛、潰瘍及其他器質性病變，并用冷生理鹽水洗凈胃內容物，濾紙拭干，再次稱取重量為空胃重量。最后取距幽門0.5 cm的胃竇組織分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定，用于免疫組化檢測；另外一份放入凍存管中快速液氮保存，再轉移到-80 ℃凍存，待后續Real-time PCR指標檢測。

1.6.3胃排空率測定 胃排空率=1-(全胃重量-空胃重量)/所灌固體糊重量×100%。

1.6.4免疫組化檢測胃竇組織IRE1、TRAF2蛋白的表達 取經4%多聚甲醛固定的胃竇組織，制作石蠟切片。按照免疫組化法說明書檢測IRE1及TRAF2蛋白的表達，鏡檢顯色呈棕黃色者為陽性表達。每只大鼠觀察2張切片，每張切片在400倍光鏡下選取5個互不重疊視野，采用正置熒光相差微成像顯微鏡及其圖像采集系統采集圖片，并以Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分析圖片，測量積分光密度(IOD) 值，取均值作為結果。

1.6.5Real-time PCR檢測胃竇組織IRE1、TRAF2 mRNA 的表達 應用TRIzol法提取胃竇組織總RNA，用紫外分光光度計測定各組樣品純度。按反轉錄試劑盒明書操作，以 20 μl為體系將總RNA轉錄成單鏈，-20 ℃保存備用。進一步以模板(20 μl)+上/下游引物(各1 μl)+無核酸酶超純水(6 μl)的反應體系，上熒光定量PCR儀進行擴增反應， 95 ℃預變性2 min，繼以 95 ℃變性20 s，退火15 s, 72 ℃延伸30 s，如此反復40個循環后，結束后 4 ℃保存，每個循環結束后，采集熒光信號。每個樣品設立3個復孔重復。結果采用相對定量2-ΔΔCt計算。

2 結果

2.1生活狀態、組織學變化大鼠在造模初期生活狀態良好，發育正常，各組之間無明顯差異。造模1周之后，除正常組外，其他組大鼠開始出現扎堆現象，毛發雜亂，情緒暴躁易激怒，夾尾大鼠體質量明顯低于正常組大鼠。造模結束，解剖胃組織，可見胃竇表面光滑，有褶皺，無黏膜出血、潰瘍、腫脹、潮紅器質性改變。

2.2藥物干預后胃排空率的比較與模型組和生理鹽水組比較，柴胡疏肝散組和多潘立酮組胃排空率均顯著升高(P<0.05)，與正常組比較，模型組、生理鹽水組胃排空率顯著減低(P<0.05)，各組F值：13.25。見表1。

表1 各組大鼠胃排空率比較

圖1 IRE1蛋白在各組大鼠胃竇的表達 免疫組織化學染色×400

圖2 TRAF2蛋白在各組大鼠胃竇的表達 免疫組織化學染色×400

2.3各組大鼠胃竇組織IRE1及TRAF2蛋白表達IRE1、TRAF2蛋白陽性表達為胞質染棕色，免疫組化顯示，柴胡疏肝散組、多潘立酮組細胞質偶見少許棕色，生理鹽水組、模型組陽性染色明顯，片狀濃染分布于胞質，見圖1、2。與模型組相比，柴胡疏肝散組和多潘立酮組IRE1、TRAF2蛋白表達明顯下降(P<0.05)，IRE1中F值：10.41，TRAF2中F值：15.18。各組結果見表2。

表2 各組大鼠胃竇組織IRE1、TRAF2蛋白表達量的比較

2.4各組大鼠胃竇組織IRE1及TRAF2的mRNA表達如圖3所示，RT-PCR檢測結果顯示，在143 bp處可見GAPDH的條帶。生理鹽水組、模型組在118 bp和123 bp處分別可見IRE1和TRAF2擴增條帶，其余組只有微量的表達。相比正常組，模型組和生理鹽水組的IRE1、TRAF2 mRNA的表達均升高(P<0.05)；相比模型組，治療組IRE1、TRAF2 mRNA表達下降的更為明顯，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠胃竇組織IRE1、TRAF2 mRNA的實時定量PCR電泳結果及相對表達量

3 討論

FD作為消化系統常見疾病，嚴重影響著人類正常的生活和健康。在對1 016個健康中國人的隨機調查中顯示：239例患有FD，其中有93例被不同程度的抑郁和焦慮困擾[7]。怎樣有效地預防與治療該疾病越來越受到醫學界的關注。中醫在防治FD方面有其獨特的優勢，臨床上應用柴胡疏肝散治療FD取得了不錯的效果[8]。

ERS是把雙刃劍，它可以通過自己的代償作用消除對機體不利的影響，但是當自身代償不足以維持內質網穩態時，通過細胞凋亡或細胞自噬途徑,細胞會發生損傷甚至死亡[9]。內質網腔中蓄積的或錯誤折疊的蛋白可通過自噬或凋亡被清除。這個過程的發生離不開內質網應激分子IRE1的參與，ERS促使IRE1與GRP78分離，通過二聚化和轉磷酸化使IRE1的核酸內切酶活性被激活，可招募接頭分子TRAF2，并可后續引起細胞自噬或凋亡等其他變化，造成FD的發生[10-11]。本研究顯示，與正常組大鼠比較，模型組胃竇的IRE1和TRAF2蛋白與mRNA表達明顯增高，說明FD大鼠的IRE1信號通路被激活。

本研究表明，與正常組比較，模型組大鼠的胃排空率偏低，說明造模使大鼠發生了胃腸動力障礙，大鼠胃竇無潰瘍、腫脹、潮紅改變，伴有情緒暴躁易怒、體重減輕，說明FD造模成功。柴胡疏肝散立足肝脾胃, 常用于治療合并有脅肋疼痛，情志抑郁易怒，胸悶喜太息，或噯氣，腹脹痞滿等癥狀的患者。柴胡疏肝散在臨床上已廣泛應用于治療FD、腸易激綜合征等胃腸動力障礙疾病，對這類疾病有明顯的改善作用[12-14]。關于柴胡疏肝散對FD大鼠內質網應激相關分子IRE1和TRAF2表達的影響，相關文獻報道較少。該研究在FD造模成功基礎上，發現復方柴胡疏肝散可以提高FD大鼠的胃排空率，同時RT-PCR和免疫組化結果顯示該藥物可以降低大鼠胃竇組織中IRE1、TRAF2基因和蛋白的表達，說明其可以抑制IRE1、TRAF2的過度表達，改善內質網應激，從而提高胃腸道細胞活力，來達到緩解FD的作用。

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