食管鱗癌組織同源異型盒B7表達及其與臨床病理特征的關系

劉玉含 閆 琛 康運凱 魏 攀

(鄭州人民醫院檢驗科，河南 鄭州 450003)

食管癌死亡率較高，多數患者在中晚期才被確診，具有較高的轉移率，預后差〔1〕。同源異型盒(HOX)B7屬于HOX基因家族B簇成員之一，它在人類DNA的合成、轉錄和修復等方面發揮重要作用，HOXB7異常表達可能導致肝癌、肺腺癌、結腸癌發生〔2～4〕。本研究探討HOXB7與食管鱗癌發生發展及轉移的關系及臨床意義。

1 材料和方法

1.1材料收集 25例食管鱗癌及癌旁正常食管上皮組織取自鄭州人民醫院手術患者，病理結果證實為食管鱗癌，其中男15例，女10例，年齡<60歲為8例，≥60歲為17例。標本收集后立即置于液氮保存，用于提取總RNA。食管鱗癌石蠟組織標本56例來自鄭州人民醫院病理科，其中男33例，女23例，年齡<60歲為14例，≥60歲為42例。全部樣品分別在食管鱗癌癌灶組織和距離腫瘤至少5 cm以外的正常食管黏膜組織處取材，所有組織標本立即用乙醇固定，后脫水、石蠟包埋，5 μm連續切片，行組織病理學診斷和免疫組化染色。病例術前均未接受放療、化療或免疫治療。

1.2主要試劑 Trizol RNA 試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自日本TAKARA公司，特異性引物購自北京奧科生物技術有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司，小鼠抗人HOXB7單克隆抗體和辣根過氧化物(HRP)標記的二抗購自美國Abcam公司，免疫組化S-P試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3RT-PCR法檢測食管鱗癌組織和癌旁正常食管組織中HOXB7 mRNA的表達水平 按Trizol試劑說明書的方法提取總RNA，用紫外分光光度儀分析純度和濃度，后取部分總RNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。收集的總RNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的去離子水中，-80℃保存。cDNA的合成按照反轉錄試劑盒說明書進行操作，實驗條件：42℃ 10 min，95℃2 min。采用Primer5.0軟件設計HOXB7引物(引物序列見表1)，β-actin作為內參。基因擴增反應條件：94℃ 5 min(1個循環)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s(30個循環)；72℃ 10 min(1個循環)。取5 μl反應產物在含EB的1.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統分析以β-actin為內參，計算HOXB7的mRNA相對表達量。HOXB7上游引物5′-TACCCCTGGATGCGAAGCTC-3′，下游引物5′-AATCTGATCTGTCTTCGTGA-3′，大小627 bp。β-actin上游引物5′-CGCCGCGCTCGTCGTCGACA-3′，下游引物5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′，大小216 bp。

1.4免疫組織化學SP法檢測食管鱗癌組織和癌旁正常食管上皮組織石蠟切片中HOXB7蛋白的表達水平 用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mmol/L，pH=7.4)替代一抗作為陰性對照。以英國Abcam公司提供的陽性切片作為陽性對照。HOXB7主要表達于細胞質中，以細胞質內出現棕黃色或黃褐色顆粒判讀為陽性細胞。評分標準：觀察并記錄組織切片中的兩項指標，染色陽性細胞占細胞總數的百分率和陽性細胞著色程度，綜合評估試驗結果。組織切片中陽性細胞占細胞總數的百分比可分為4級：陽性細胞<10%，0分，10%～25%，1分，26%～50%，2分，>50%，3分。組織切片中細胞染色強度分為3級：未著色，0分，淡黃色，1分，棕褐色2分。2項指標的結果相乘得到0分為(-)，≥1分為(+)。染色結果及評分由2位經驗豐富的病理科醫生獨立操作進行。

1.5統計學分析 應用SPSS19.0統計學軟件進行t檢驗或方差檢驗及χ2檢驗。

2 結 果

2.1食管鱗癌和癌旁正常食管組織中HOXB7 mRNA的表達 HOXB7 mRNA在食管鱗癌中明顯高表達，而在正常食管上皮中表達較低(圖1)。25例食管鱗癌標本中HOXB7 mRNA相對表達量為(0.612±0.094)，而癌旁正常食管組織中HOXB7 mRNA表達量為(0.108±0.035)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2食管鱗癌和癌旁正常食管組織中HOXB7蛋白的表達 食管鱗癌組織中HOXB7蛋白表達率〔62.50%(35/56)〕明顯高于正常食管上皮〔16.07%(9/56)；P<0.05〕。

2.3HOXB7蛋白表達與食管鱗癌臨床病理資料之間的關系 HOXB7蛋白的表達水平與食管鱗癌的組織分化程度、TNM分期、浸潤程度和淋巴結轉移相關(P<0.05)，不同性別和年齡患者HOXB7表達差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

M：Marker;1,2:正常食管組織；3，4：食管癌組織圖1 食管鱗癌及癌旁正常組織中HOXB7 mRNA及β-actin 的電泳條帶

表1 食管癌患者不同臨床病理HOXB7蛋白陽性表達差異

3 討 論

HOXB7基因定位于人染色體17q21.3〔4〕，HOXB7基因所編碼的蛋白均為轉錄調節因子，可與細胞外基質相關信號分子、血管內皮生長因子、黏附因子及堿性成纖維細胞生長因子等相互結合發揮作用，從而抑制或者激活相應下游靶基因序列，參與多種生物學活動〔5〕。文獻證明HOXB7在胰腺癌〔6〕、胃癌〔7〕和惡性黑色素瘤〔8〕等多種惡性腫瘤中均有過度表達。趙宇清等〔9〕通過下調HOXB7基因的表達，發現卵巢癌SKOV3細胞的增殖受到抑制，細胞G1期發生阻滯，細胞凋亡增多，同時細胞周期相關蛋白CyclinD1和CyclinE表達下降，因此認為，HOXB7可直接影響細胞周期調控。本研究結果說明HOXB7在食管鱗癌中起原癌基因的作用，HOXB7可能是參與食管鱗癌進展的有價值的新的腫瘤標志物。本文結果與原薇薇等〔3〕在肺腺癌組織中研究結果大致相同，提示HOXB7過表達與食管鱗癌的侵襲和轉移密切相關。

4 參考文獻

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2張念杰，張剛慶，高 鵬，等.同源盒基因B7在肝癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.實用醫學雜志，2013；29(11)：1776-9.

3原薇薇，譚 艷，杜 敏，等.HOXB7基因在肺腺癌中的表達及其臨床意義〔J〕.臨床腫瘤學雜志，2014；19(11)：987-91.

4王冬清，嚴東旺，唐華美，等.同源異形盒基因HOXB7在結腸癌中的表達及臨床意義〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(3)：438-40.

5Cantile M，Franco R，Schiavo G，etal.The HOX genes network in uro-genital cancers：mechanisms and potential therapeutic implications〔J〕.Curr Med Chem，2011；18(32)：4872-84.

6郭 貞，江衛華，金子良，等.下調轉錄因子HOXB7抑制胰腺癌BXPC3細胞侵襲及遷移機制研究〔J〕.現代腫瘤醫學，2015；23(10)：1344-8.

7周崇治，韓 楊，凃威偉，等.同源盒基因家族在胃癌中差異表達的研究〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(7)：1507-10.

8彭思達，葛林虎，王春燕，等.siRNA對惡性黑色素瘤A375細胞中HOXB7基因的干涉作用研究〔J〕.中國腫瘤臨床，2007；34(6)：312-5.

9趙宇清，黃 妍，高蜀君，等.下調HOXB7基因對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響及機制探討〔J〕.中國癌癥雜志，2013；23(3)：173-8.