TLR-MyD88通路在COPD炎癥反應中的作用及萊菔硫烷的抗感染效果

王 婧 王 敏 范玉敏 王 燕

(甘肅中醫藥大學繼續教育學院,甘肅 蘭州 730000)

研究發現，下呼吸道病原菌定植可能是導致慢性阻塞性肺病(COPD)患者氣道生理功能失調和炎癥反應的主要原因〔1〕。肺泡巨噬細胞是介導COPD氣道炎癥的主要細菌之一，其分泌出的細胞因子可調控局部免疫反應，在炎癥反應中發揮重要作用〔2〕。TLR4是肺泡巨噬細胞表面病原菌識別受體，被激活后可啟動MyD88依賴的信號通路，激活核因子(NF)-κB、MAPKs，引發炎癥反應，在免疫屏障和氣道炎癥中發揮關鍵作用〔3〕。萊菔硫烷是從十字花科植物中提取的成分，具有抗癌、抗感染作用，可抑制NF-κB通路活化，可能對COPD的炎癥反應有抑制作用〔4〕。COPD患者肺功能偏低，難以通過支氣管肺泡灌洗獲取肺泡巨噬細胞，而外周血單核細胞源性巨噬細胞的生物學功能與其相似，可替代肺泡巨噬細胞作為體外研究模型〔5〕。本次研究采用外周血單核細胞源性巨噬細胞探討TLR-MyD88信號通路在COPD中的作用及萊菔硫烷的抗感染效果。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年1～12月酒泉市人民醫院住院患者中COPD穩定期患者64例為COPD組，男44例，女20例，年齡57～89歲，平均(72.69±7.01)歲；中度44例、重度14例、極重度6例。選取同年齡段肺功能正常的體檢者60名為非COPD組，男40名，女20名，年齡58～77歲，平均(70.05±5.69)歲。本研究通過醫院倫理委員會審批，入選患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 DMEM細胞培養基、集落刺激因子、胰蛋白酶購于上海慧穎生物科技有限公司；萊菔硫烷購于上海賓智生物科技有限公司；TLR4、MyD88 PCR擴增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；兔抗人Tlr4多克隆抗體、鼠抗人MyD88多克隆抗體、鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購于上海遠慕生物科技有限公司。

1.3巨噬細胞培養及鑒定 抽取兩組受試者空腹外周靜脈血15 ml，抗凝處理后梯度離心分離單核細胞，按4×109/L密度接種到24孔板中，CO2孵箱中常規培養2 h，收集貼壁細胞放入含終濃度為3 μg/L集落刺激因子的DMEM完全培養基，置于37℃ CO2孵箱中培養10 d。取對數期單核細胞和巨噬細胞，胰酶消化后，2 000 r/min離心10 min，棄去上清，滴加AO/EB溶液懸浮細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。同時采用流式細胞術檢測單個核細胞和巨噬細胞表面CD14表達情況。

1.4分組與干預 將COPD組的巨噬細胞分4組：空白對照組、脂多糖組(終濃度為1 mg/L的脂多糖干預)、萊菔硫烷組(終濃度為30 μmol/L的萊菔硫烷干預)、聯合干預組(終濃度為1 mg/L的脂多糖和30 μmol/L的萊菔硫烷聯合干預)，干預時間根據基因、蛋白檢測的不同分為12 h和36 h。非COPD組巨噬細胞不給予任何干預，細胞密度4×106/L。

1.5實時熒光定量PCR檢測 提取巨噬細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA。TLR4上游引物：5′-TCCTACTACGGTCCTCCTAC-3′，下游引物：5′-AGTCCAGGTCCAAGAACGG-3′，擴增長度182 bp；MyD88上游引物：5′-TCGGTCCGACCTCGTTCCAT-3′，下游引物：5-CCGTCGATTTACGGAGTTCT-3′，擴增長度85 bp；內參GADPH上游引物：5′-CGTGGCAGTTCCGACTCTTG-3′，下游引物：5′-ACCACTTCTGCGGTCACCTA-3′，擴增長度127 bp。擴增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環，延伸72℃ 5 s，55℃ 20 s。2-△△Ct法檢測TLR4、MyD88基因表達情況。

1.6Western印跡檢測 提取細胞總蛋白，測定濃度后取50 μg樣品行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，重復2次，濕法轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)，室溫下脫脂奶粉封閉1 h，滴加兔抗人TLR4多克隆抗體(1∶1 000)、鼠抗人MyD88多克隆抗體(1∶1 000)，內參為鼠抗人β-actin抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，滴加HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)、羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室溫下反應2 h。電化學發光法(ECL)顯色，檢測各特異性條帶灰度值。

1.7酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測細胞培養上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6濃度 收集各組巨噬細胞培養液上清，-80℃保存待測，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6濃度，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.8統計學分析 應用SPSS6.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1細胞形態學觀察及流式細胞術鑒定 外周血單核細胞體積較小，呈圓形，細胞核位于中央；集落刺激因子作用后細胞體積明顯增加，多為圓形，少數周邊有板形突起，顆粒較多，呈現巨噬細胞形態學特征。見圖1。流式細胞術檢測顯示，外周血單核細胞中CD14表達量為(89.61±5.97)%，明顯高于巨噬細胞中的(42.15±9.30)%，差異有統計學意義(P<0.01)，說明單核細胞成功誘導為巨噬細胞。

2.2各組巨噬細胞TLR4、MyD88 mRNA表達情況 非COPD組、空白對照組、脂多糖組、萊菔硫烷組、聯合干預組TLR4 mRNA相對表達量分別為：1.00±0.00、3.65±0.49、5.69±0.95、1.34±0.52、3.10±0.61；MyD88 mRNA相對表達量分別為：1.00±0.00、1.87±0.30、3.31±1.75、1.15±0.52、1.62±0.81。基礎狀態下COPD組巨噬細胞中TLR4、MyD88 mRNA表達水平均明顯高于非COPD組，差異有統計學意義(P<0.05)；COPD組巨噬細胞經脂多糖刺激后，TLR4、MyD88 mRNA表達水平明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；萊菔硫烷組、聯合干預組TLR4、MyD88 mRNA表達水平明顯低于脂多糖組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。萊菔硫烷組TLR4、MyD88 mRNA表達水平與非COPD組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組巨噬細胞TLR4、MyD88 蛋白表達情況 非COPD組、空白對照組、脂多糖組、萊菔硫烷組、聯合干預組TLR4蛋白相對表達量分別為：0.37±0.05、0.56±0.13、0.76±0.17、0.36±0.10、0.44±0.21；MyD88 蛋白相對表達量分別為：0.69±0.35、1.22±0.76、1.75±0.71、0.73±0.45、0.88±0.36。COPD組巨噬細胞中TLR4、MyD88 蛋白表達水平均明顯高于非COPD組，差異有統計學意義(P<0.05)；脂多糖組TLR4、MyD88 蛋白表達水平明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；萊菔硫烷組、聯合干預組TLR4、MyD88 蛋白表達水平明顯低于脂多糖組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。萊菔硫烷組TLR4、MyD88 蛋白表達水平與非COPD組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察單核細胞和巨噬細胞形態學特征(×400)

1.非COPD組；2.空白對照組；3.脂多糖組；4.萊菔硫烷組；5.聯合干預組圖2 各組巨噬細胞TLR4、MyD88 蛋白電泳

2.4各組巨噬細胞TNF-α、IL-6分泌情況 非COPD組、空白對照組、脂多糖組、萊菔硫烷組、聯合干預組巨噬細胞培養液上清中TNF-α濃度(μg/L)分別為：20.15±3.09、32.90±5.61、48.77±5.37、21.64±4.25、32.98±4.33；IL-6濃度(μg/L)分別為：32.91±5.47、44.12±5.69、55.71±6.35、28.68±4.80、34.16±5.49。COPD患者TNF-α、IL-6濃度均明顯高于非COPD組，差異有統計學意義(P<0.05)；脂多糖組TNF-α、IL-6濃度明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；萊菔硫烷組、聯合干預組TNF-α、IL-6濃度明顯低于脂多糖組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；萊菔硫烷組TNF-α、IL-6濃度與非COPD組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

COPD患者下呼吸道存在多種微生物定植，可引發持續的氣道炎癥反應，其中肺泡巨噬細胞發揮重要作用。肺泡巨噬細胞具有包括抗原呈遞、調節炎性因子分泌、吞噬在內的多種生物學功能〔6〕。激活肺泡巨噬細胞可釋放大量炎性因子及蛋白酶，同時匯聚炎癥細胞，參與炎性反應、組織損傷及修復。相關研究顯示，COPD患者肺泡巨噬細胞吞噬細菌功能障礙，是下呼吸細菌定植的主要誘因〔7〕。單核細胞源性巨噬細胞在表型和生理功能方面與肺泡巨噬細胞相似，可作為肺泡巨噬細胞研究模型。本次研究通過流式細胞術檢測顯示，外周血單核細胞表面CD14表達水平較高，誘導成巨噬細胞后CD14表達水平明顯下降，結合熒光顯微鏡下形態學觀察，提示成功誘導為巨噬細胞。

TLR4作為膜識別受體，多表達于免疫細胞、上皮細胞和內皮細胞，其中以巨噬細胞和樹突細胞最為多見，脂多糖是TLR4的主要配體。配體激活TLR4后，可經MyD88依賴途徑傳導，激活IL-1、TNF-6受體相關因子，介導炎性因子轉錄。相關研究發現，脂多糖刺激氣道上皮細胞中TLR4表達，是COPD發病的主要因素之一〔5〕。脂多糖可通過TLR-MyD88信號通路提高大鼠肺泡巨噬細胞中IL-6、TNF-α等細胞因子水平，在肺炎的發生、發展中發揮調控作用〔8〕。本研究提示COPD患者氣道可能在定植菌長期刺激下，巨噬細胞經表面TLR4識別MyD88信號通路，誘發炎癥反應并維持炎癥狀態。脂多糖刺激后，TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表達水平和TNF-α、IL-6分泌量均增加，提示脂多糖刺激經TLR-MyD88信號通路加重炎癥反應，該信號通路可能參與COPD的炎癥過程。

萊菔硫烷易溶于水，存在于甘藍、西蘭花、蘿卜等十字花科蔬菜的根、莖、種子中，可誘發腫瘤細胞凋亡和清除，具有抗癌作用，是癌癥治療研究的新熱點。近年來研究發現，萊菔硫烷還具有較強的抗炎、抗氧化作用，可通過抑制小鼠前B細胞中TLR4聚集，抑制炎癥反應〔9〕。本研究提示萊菔硫烷可通過抑制TLR-MyD88信號通路減少下游炎性因子的釋放并發揮抗感染作用。

4 參考文獻

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