銀杏葉多糖對高脂飲食誘導的糖尿病視網膜病變保護作用及機制

齊 若 周利曉 顧志敏 霍銀平

(鄭州大學第五附屬醫院眼科，河南 鄭州 450052)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病嚴重的并發癥之一〔1〕。然而，到目前為止，對DR還沒有高效無害的治療措施。 本研究擬觀察銀杏葉多糖(PGBL)對糖尿病動物模型視網膜神經節細胞及其對基質金屬蛋白酶(MMP)-9、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 PGBL(西安天瑞有限公司)；Trizol (生工生物技術有限公司)；MMP-9、iNOS 引物 (生工生物科技有限公司)；血糖試劑盒，南京建成生物工程研究所。UV-1100紫外-可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司。PCR儀(Thermo賽默飛世爾科技公司，美國)，BH-Nxe-B 型倒置顯微鏡(日本 Olympus Optical 公司)。

1.2動物 購于廣東省實驗動物中心，SPF級SD大鼠，雄性，30只，體重220～280 g。造模方法：將SD大鼠適應性喂養10 d后，隨機挑選20只喂養高脂飼料，其余大鼠喂養正常飼料，為正常組(N)。高脂飼料造模45 w后，通過眼靜脈叢取血，前三滴血棄去，檢測其血糖值，空腹血糖>16.7 mmol/L，則模型成立。隨后將糖尿病大鼠隨機分為模型組(DM)與PGBL組各10只。各組大鼠均飼養在SPF級動物房中，自由飲純凈水。給藥方法：PGBL組中，每只大鼠按150 mg·kg-1·d-1灌胃PGBL溶液。DM組和N組均灌服等體積生理鹽水，連續12 w。

1.3取材 將每組大鼠處死后取出的右側眼球，立即放入-80℃超低溫冰箱內保存。在解剖顯微鏡下沿角膜緣后2 mm切開，眼科剪環形剪開，去除掉眼前節，利用重力與慣性將玻璃體緩慢去除，視網膜會隨之脫出，將兩者分開即可得到視網膜組織。

1.4葡萄糖耐量實驗(OGTT) 大鼠禁食12 h，尾靜脈取血一滴，血糖儀測其空腹血糖值(0 min)，然后以2.5 g/kg劑量灌胃大鼠葡萄糖溶液，分別于灌胃后30、60、120、180 min取血測定各組大鼠相應時間點血糖值。根據各時間點的血糖值，繪制血糖時間曲線圖。

1.5視網膜神經節細胞存活計數 于缺血再灌注損傷前1 d利用熒光金逆行追蹤劑標記視網膜神經節細胞。用10%水合氯醛麻醉大鼠，固定頭部，將頭皮沿著頭骨中線旁，約上丘的位置制備2個孔洞，注入熒光金。手術完成后縫合傷口。于實驗后處死大鼠，將眼球小心取出，將眼球避光固定于多聚甲酸1 h后，將視網膜取出，鋪于載玻片上，在顯微鏡下計數神經節細胞。

1.6實時定量聚合酸鏈反應 將眼視網膜組織加入Trizol中勻漿，每1 ml Trizol 加入 0.2 ml三氯甲烷；劇烈混合30 s后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相層液體小心轉移至新的離心管中；然后加入0.5 ml異丙醇，混合均勻，室溫靜置10 min；隨后4℃，12 000 r/min離心10 min，可見少量RNA沉淀；吸棄上清溶液，用75%乙醇洗滌沉淀兩次；4℃ 7 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清，空氣中干燥RNA沉淀，用DEPC水溶解RNA沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測定RNA純度及濃度；計算總RNA濃度。將溶解后的RNA按說明試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增。引物iNOS：前向:5′-GCAACATCAGGTCGGCCATTACT-3′,反向:5′-AGCCCAGGTCGATGCACAAC-3′;MMP-9:前向:5′-TGCGCTGGGCTTAGATCATT-3′,反向:5′-TGGATGCCTTTTATGTCGTCTTC-3′;actin:前向:5′-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAA-3′,反向:5′-TGAAGCTGTAGCCACGCTCGGTC-3′，擴增條件為95℃，2 min；95℃，5 s，60℃，32 s，共40個循環。

1.7統計學處理 采用SPSS10.0軟件行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1PGBL對各組大鼠一般狀態體重、空腹血糖水平的影響 給藥12 w后，與N組大鼠比較，DM組大鼠活動減少，毛發枯黃易脫落、脾性暴躁，給予PGBL干預后，大鼠精神狀況明顯改善，活動較活躍，毛發光滑不易脫落，進食量稍增加，飲水量及尿量均少于DM組。與N組〔(338.6±41.8)g，(6.1±0.7)mmol/L〕相比，DM組大鼠體重〔(217.4±25.2)g〕顯著下降、空腹血糖〔(17.8±2.2)mmol/L〕明顯增高(P<0.01)。PGBL組大鼠與DM組比較，體重〔(256.9±30.1)g〕上升(P<0.05)、空腹血糖〔(14.3±1.6)mmol/L〕明顯下降(P<0.05)。

2.2PGBL對各組大鼠葡萄糖耐量的影響 各組大鼠灌胃葡萄糖后，血糖水平均出現不同程度上升，然后慢慢下降，至180 min血糖值趨于平穩。在這一過程中，DM組大鼠各時間點血糖值均高于N組(P<0.01)，在30 min內達到峰值，隨后N組大鼠血糖恢復到正常狀態，DM組大鼠在180 min后血糖值仍維持在較高水平；與DM組相比，PGBL組大鼠在給藥的30 min內出現血糖峰值，后血糖值逐漸下降，在180 min，PGBL組血糖值均低于DM組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。說明DM組大鼠的糖耐量受損，對血糖的調節能力降低，PGBL可以改善這一受損狀況，但不顯著。

與N組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與DM組相比：3)P<0.05，4)P<0.01圖1 各組大鼠OGTT實驗中各測定點的血糖值

2.3PGBL對視網膜神經節細胞存活數目的影響 DM組大鼠神經節細胞存活數目(768.2±84.9)較N組(1 428.1±159.7)明顯下降(P<0.01)，PGBL干預后，大鼠神經節細胞存活數目(1 103.5±123.6)顯著增加(P<0.05)。表明DM組大鼠視網膜神經節細胞數減少可能是糖尿病所致，而PGBL可以增加損傷后存活的神經節細胞數目。

2.4PGBL對于視網膜MMP-9及iNOS RNA表達水平的調節 DM組大鼠視網膜MMP-9及iNOS RNA表達水平(0.41±0.11，0.39±0.08)較N組(1.63±0.34，1.42±0.21)明顯下降(P<0.01)，PGBL給藥干預后，能顯著上調MMP-9及iNOS RNA表達(0.82±0.20，0.73±0.15；P<0.05)。說明銀杏葉多糖可以上調糖尿病大鼠視網膜MMP-9及iNOS的RNA表達。

3 討 論

糖尿病最嚴重的眼部并發癥就是DR，但其發病機制還沒有得到公認的解釋。以前科學界普遍認為糖尿病微循環障礙是引起視網膜缺血缺氧的關鍵因素〔2〕。目前認為DR的發生大多與各類細胞因子的異常導致的氧化應激有關，還有學者提出，醇-肌代謝異常、蛋白激酶C的激活是引發DR的關鍵因素〔3〕。近年來，大量研究也表明：糖尿病患者的視功能障礙大多發生在DR微血管病變發生以前，因此推斷DR的主要發病機制可能由視網膜神經元被影響開始，進而導致體內血液平衡失調，最終導致糖尿病代謝紊亂〔4〕。DR晚期對視力損害非常嚴重，甚至可能會致盲，遺憾的是，目前醫學界對此還沒有全面的認識及科學有效的治療。視網膜神經節細胞的軸突主要是將視覺信號沿視路傳遞到中樞形成視覺，是視網膜對視覺信息處理及傳遞三級神經元的重要組成成分。糖尿病患者的視功能狀況與視網膜神經節細胞的數量和功能有關〔5～8〕。在DR初期，視網膜神經節細胞數量出現明顯下降，因此有人提出DR可能是神經退行性的病變。本實驗中，PGBL能顯著上調糖尿病大鼠的視網膜神經節細胞的數目，刺激其活性，說明PGBL對RGCs有抗凋亡作用。MMPs是一種內源性肽酶。神經元細胞的死亡正是由于MMP-9將細胞與基質的連接打破，進而導致腦血流屏障被破壞所導致〔6〕。有研究發現，MMP-9水平的升高會導致神經節細胞的損傷〔9～12〕。在多種眼部炎癥疾病或者神經病變性疾病中發現iNOS有明顯的細胞毒性，同時，由高眼壓導致的急性視網膜缺血會升高COX-2及iNOS的水平〔13〕。

銀杏葉是近年來國內外藥物研究開發的熱點之一。近年來已發現PGBL具有很多生物活性。多糖是一種公認的無細胞毒性免疫促進劑，有研究發現，PGBL可顯著激活腹腔吞噬細胞，有較強的激活非特異性免疫的功能。PGBL能有效清除自由基，有較強的抗氧化作用〔14，15〕。本研究中發現，PGBL能降低糖尿病大鼠血糖，有效上調糖尿病大鼠的視網膜神經節細胞的數目，對DR具有一定的保護作用，且可能是通過下調糖尿病大鼠視網膜MMP-9及iNOS RNA表達來實現的。

4 參考文獻

1Coronado AC，Zaric GS,Martin J,etal.Diabetic retinopathy screening with pharmacy-based teleophthalmology in a semiurban setting：a cost-effectiveness analysis〔J〕.CMAJ Open，2016；4(1)：E95-102.

2Kim TK，Won YJ,Shin J,etal.The association of metabolic syndrome with diabetic retinopathy：the Korean National Health and Nutrition Examination Survey 2008-2012〔J〕.PLoS One，2016；11(6)：e0157006.

3Tangjai P，Chingchana P，Taweerutchana R.Glycated haemoglobin and diabetic retinopathy in type 2 diabetic patients in hrh princess maha chakri sirindhorn medical center〔J〕.J Med Assoc Thai，2015;98 Suppl 10：S135-42.

4Adamiec-Mroczek J，Zajac-Pytrus H，Misiuk-Hojlo M.Caspase-dependent apoptosis of retinal ganglion cells during the development of diabetic retinopathy〔J〕.Adv Clin Exp Med，2015；24(3)：531-5.

5Meyer-Rusenberg B，Pavlidis M,Stupp T,etal.Pathological changes in human retinal ganglion cells associated with diabetic and hypertensive retinopathy〔J〕.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2007；245(7)：1009-18.

6Kowluru RA，Mohammad G,dos Santos JM,etal.Abrogation of MMP-9 gene protects against the development of retinopathy in diabetic mice by preventing mitochondrial damage〔J〕.Diabetes，2011；60(11)：3023-33.

7Chen J，Luo M,Wang W,etal.Altered proteolytic activity and expression of MMPs and aggrecanases and their inhibitors in Kashin-Beck disease〔J〕.J Orthop Res，2015；33(1)：47-55.

8Chopra K，Baveja A,Kuhad A,etal.MMPs：a novel drug target for schizophrenia〔J〕.Exp Opin Ther Targets，2015；19(1)：77-85.

9Abu El-Asrar AM，Siddiquei MM,Nawaz MI,etal.Coexpression of heparanase activity，cathepsin L，tissue factor，tissue factor pathway inhibitor，and MMP-9 in proliferative diabetic retinopathy〔J〕.Mol Vis，2016；22：424-35.

10Sarkar J，Nandy SK,Chowdhury A,etal.Inhibition of MMP-9 by green tea catechins and prediction of their interaction by molecular docking analysis〔J〕.Biomed Pharmacother，2016；84：340-7.

11Strzelecki D，Kaluzyńska O,Szyburska J,etal.MMP-9 serum levels in schizophrenic patients during treatment augmentation with sarcosine (Results of the PULSAR Study)〔J〕.Int J Mol Sci，2016；242(7)：54-60.

12Luca F,Rossella S,Salvatore T，etal.MMP-9 overexpression is associated with intragenic hypermethylation of MMP9 gene in melanoma〔J〕.Aging (Albany NY)，2016；8(5)：933-44.

13Uthra S，Raman R,Mukesh BN,etal.Diabetic retinopathy：validation study of ALR2，RAGE，iNOS and TNFB gene variants in a south Indian cohort〔J〕.Ophthalmic Genet，2010；31(4)：244-51.

14Yan Z，Fan R,Yin S,etal.Protective effects of Ginkgo biloba leaf polysaccharide on nonalcoholic fatty liver disease and its mechanisms〔J〕.Int J Biol Macromol，2015；80：573-80.

15Yang Y，Liu P,Chen L,etal.Therapeutic effect of Ginkgo biloba polysaccharide in rats with focal cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury〔J〕.Carbohydr Polym，2013；98(2)：1383-8.