摻雜硅的羥基磷灰石負載骨形態發生蛋白-2活性多肽在大鼠顱骨缺損修復中的作用

仇志學 單中書 李國棟 劉立民

(青海省人民醫院骨科，青海 西寧 810007)

骨缺損主要病因有創傷、感染、腫瘤及各種先天性疾病等。骨缺損較小時一般可自行愈合，但當骨缺損較大時則需要手術治療〔1～3〕。組織工程骨技術即利用組織工程手段，使得缺損部位具有成骨能力的細胞進行生長，引導骨組織再生，構建培育新生骨組織以填補骨缺損實現骨性愈合與良好修復。骨形態發生蛋白(BMP)-2是誘導骨細胞生成的重要因子〔4,5〕。但是由于BMP-2含量甚微，生產工藝復雜，所以無法大量提純，另外，BMP-2僅能作為一種誘導刺激物，使未分化間充質細胞向骨系細胞轉化成骨，卻無支架和充填缺損作用，因而使其臨床應用受到限制。羥基磷灰石(HAP)是一種磷酸鈣類天然骨礦，相容性良好，是骨組織的主要成分，但其脆性較大，不利于骨缺損修復，為此可摻雜其他天然衍生物或高分子成分以提高其強度。研究者〔6〕通過鈦摻雜合成了具有良好燒結穩定性的HAP納米粉，鈦摻雜對HAP的燒結穩定性、晶粒尺寸和形貌有顯著影響。有研究〔7〕采用鈦摻雜HAP/氧化鋯復合材料，抑制了HAP與氧化鋯之間的熱反應，把鈦離子摻入HAP的晶格，使其表現出良好的相穩定性。而硅(Si)是人體骨骼必需的材料，在早期可促進骨的礦化，能有效促進骨的修復。近年來采用凍干法制備含Si的HAP支架得到臨床的廣泛重視。本研究采用Si代HAP(Si-HAP)負載BMP-2活性多肽P28修復大鼠顱骨缺損，探究其有效性。

1 資料與方法

1.1合成P28 P28從BMP-2的肽73～92關節位表中提取后利用FMOC/TBU固相肽合成法合成，并將初始合成得到粗肽多次通過凝膠過濾層析得到進一步純化，最后高效液相色譜法(HPLC)測定P28 純度≈96.8%。

1.2制備及觀察Si-HAP 共同沉淀法合成法：先將270 ml硝酸鈣與正硅酸乙烯溶液相混合而成，后再將300 ml 0.06 mol/L(NH4)H2PO4溶液加入到混合物中。鈣與磷的比例保持在1∶1.65，且Si與鈣的比例會因加入不同正硅酸乙烯在1%～10%間變化。所有的反應需保持溫度在80℃且pH值在9～10之間可用的銨溶液。3 h后，所有已獲得的沉淀通過過濾和蒸餾水的洗滌從這些溶液中分離。然后將Si-HAP納米粒子放在80℃的烤箱中過夜以干燥。使用電子掃描顯微(SEM) 觀察Si-HAP形態，為了使得制備得到Si-HAP具有更好的導電性，所有的樣品都用10 nm厚的Au薄膜覆蓋后使用掃描電子顯微鏡來檢查涂層的形態，鋅與鈣的比例使用能量色散光譜儀來測定。

1.3制備復合材料 分別將100 mg HAP和Si-HAP預濕后加入純乙醇放入攪拌機內輕攪200 r/min×2 h，然后使用軌道振動篩使其和10 mg P28復合，靜置合成后的物料，待其干燥前用去離子水清除乙醇。所有材料完全去除乙醇后于-20℃下冷存備用。

1.4實驗動物 選取6～8 w SD雄性大鼠30只(華中科技大學同濟醫學院動物中心提供，動物許可證編號HB20140014)，體重200～250 g，二級清潔，健康，飼養于清潔級環境下。采用隨機數字表法分為A、B、C組各10只，A組為空白對照組、B組HAP+P28修復、C組Si-HAP+P28修復。

1.5外科處理 B組、C組采用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，手術區被毛，消毒鋪巾，于大鼠顱骨正中縱向行1.5 cm切口，暴露顱骨，鉆孔形成一直徑5 mm的圓形缺損，將HAP+P28植入B組缺損處和將Si-HAP+P28植入C組缺損處，A組不做處理。用生理鹽水沖洗后逐層縫合傷口。分別觀察記錄3組術后第6、12周的一般情況、影像學檢查及組織學檢查結果。

1.6CT圖像評價 術后6～12 w，每組取5只大鼠注射過量戊巴比妥鈉處死后將顱骨摘除，使用三維CT重建術掃描大鼠顱骨觀察是否形成新骨，儀器采用德國西門子SOMATOM sensation 64排螺旋CT，通過圖像輔助處理軟件對CT圖像進行顱骨缺損修復比例的判斷。

1.7解剖組織學觀察 將獲取顱骨浸泡于10%甲醛溶液中，加入10%乙二胺四乙酸(EDTA)并調整pH值為7.0，于4℃下保存3 w進行完全脫鈣，取出脫水和后，石蠟包裹顱骨，使用自動切片機取厚度約5 mm切片，后使用蘇木素-伊紅(HE)染色后使用光學顯微鏡觀察并拍片，使用計算機圖像分析系統測量片內骨形成量。圖像系統為HPIAS21000 高清晰度圖像處理系統，購自武漢千屏影像技術有限責任公司。

1.8統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t、χ2檢驗。

2 結 果

2.1一般情況比較 實驗前各組周齡和體重差異無統計學意義(P>0.05)。大鼠經手術后，生命體征均正常，沒有發生實驗過程中死亡。植入部位沒有發生感染，無化膿、潰破等情況。

2.2影像學指標比較 術后6 w，A組CT影像顯示缺損處新骨生成情況較差，修復比例為12.7%，B組顱骨缺損處新骨生成情況明顯，修復比例為66.5%，C組缺損處基本被新骨覆蓋，修復比例為95.8%，3組組間差異有統計學意義(P<0.05)；12 w后，A組修復比例為37.2%，B組97.8%，C組100%，B組和C組修復效果相似，顯著優于A組(P<0.05)，見圖1。

2.3組織學觀察比較 術后6 w，C組顱骨缺損處生成大量的成纖維細胞和肉芽組織，軟組織恢復情況良好。B組存在生物材料退化和分散的骨樣組織。而A組則更為明顯，軟組織壞死面積較大呈現黑色；術后12 w，C組顱骨骨小梁形成緊湊骨組織，且肉芽組織轉化為纖維組織將修復植入物完全包裹，缺損處肌肉組織和正常肌肉組織同樣平滑細膩。B組顱骨恢復僅剩下帶狀缺損及軟組織壞死，恢復效果較好。A組仍殘留較大壞死軟組織，缺損處無明顯骨形成，見圖2。

圖1 3組6、12 w顱骨缺損修復CT掃描圖

圖2 3組術后6、12 w缺損處形態學(HE，×400)

3 討 論

近年來，骨缺損的修復逐漸成為骨組織工程領域的熱點〔8〕。自體骨由于一方面具有天然骨的正常生理結構，另一方面含有促進骨組織修復再生的細胞與生長因子，因而被認為是進行骨缺損修復最理想的材料〔9〕。但由于存在自體骨與缺損骨形態不一致、取骨量受到限制及骨吸收過程的不確定性等原因，使其尚未能廣泛應用于臨床〔4〕。而組織工程骨則可突破上述限制，通過人體組織工程制備出具有良好的骨誘導活性、骨傳導性、骨降解性及免疫排斥性較低的人工骨材料〔2〕。

在骨組織工程中，BMP、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等均具有誘導骨細胞及軟骨細胞生成的作用，由于BMPs是骨形成過程中的三種促進因子之一，它們在生物體的生長過程中起著重要的調控作用。BMP-2的骨誘導活性最強〔10〕。BMP-2是一種多功能生長因子，屬于轉化生長因子超家族成員，是最重要的骨形成調控因子〔11〕。BMP-2可通過刺激骨髓基質未分化的間充質細胞，促進其黏附、體外增殖及定向分化為成骨前體細胞，形成軟骨內成骨，從而誘導新生骨組織形成〔12〕。但是BMP-2在體內半衰期一般小于16 min，降解速度極快〔13〕。則臨床應用中需選擇性能優良的緩釋載體負載BMP-2，使BMP-2在體內緩慢釋放，從而能長時間發揮骨缺損的修復作用，提高機體對BMP-2的利用率〔14〕。性能優良的緩釋載體不僅需要具備強大的緩釋能力，還需要具有誘導成骨細胞黏附增值的能力〔15〕，單一的生物材料難以滿足上述條件，為此復合材料成為骨組織工程技術優先考慮的材料。

研究顯示，HAP是天然骨組織礦物質成分，具有較高的組織相容性，對某些化學分子及蛋白質具有較高親和力，具有較強的誘導骨生成的能力〔16〕。但由于HAP與骨組織的整合速率及反應性較低，從而延長了骨缺損修復時間〔17〕。為了優化HAP的臨床性能，研究人員發現在HAP中摻雜某些微量元素，如Si〔18〕。Si離子的摻入可改變HAP的表面晶型，增強HAP的骨活性，可顯著提高HAP誘導骨細胞和軟骨細胞增殖生成的能力和速度，并且可提升骨組織的抗菌能力〔19〕。研究〔20〕表明，與適宜的載體復合來修復骨缺損比單用BMPs或單用其載體本身誘導成骨的效果更好。該生長因子能誘導植入區周圍未分化的間充質細胞形成軟骨和新生骨，促進成骨細胞分化成熟，參與骨和軟骨生長發育及其重建過程，進而加速骨缺損修復。通過該工藝控制制備出的P28經過發酵、分離、純化后得到的樣品可保持很高的純度，消除了潛在的病源傳播危險，展示出美好的應用前景。在人重組BMP-2化學結構基礎上自行設計合成的相關活性多肽P28能夠發揮與其相同的特異性與骨結合促進成骨的作用。研究發現〔20〕，P28的生物效應是通過其分子的抗原決定族與細胞膜上的受體形成異聚復合物來實現的，而P28短鏈多肽可以通過多肽合成儀大規模制備，降低了成本，提高材料的安全性。同時，短鏈多肽上與細胞表面受體結合的活性位點能夠充分暴露，具有更強的生物活性，其可以增強材料的骨誘導性和生物相容性，為P28活性多肽復合物的開發及應用創造了條件。有學者〔21〕證實了P28活性多肽具有體外定向誘導大鼠骨髓間充質干細胞(BMSC)向成骨方向定向分化的作用，且這種誘導作用具有劑量依賴性，高分子聚合材料復合該多肽后具有骨誘導活性，增強成骨能力。

Si的加入的確可以改變復合材料的臨床性能。可能與Si的強化作用大大提高了力學性能、顯著促進成骨細胞的增殖和分化有關〔19〕。P28可促進骨骼生產及生長原因可能包括如下：①P28中包含有BMP序列內能夠誘導成骨分化關鍵基因片段，能夠促使骨骼祖細胞分化；2P28分子量更小，且由于是人工合成，其機構更加穩定，有效克服BMP-2因其復雜結構而導致部分活性位點難以暴露的劣勢；③P28氨基酸序列內含有多種脯氨酸，且其是生物體皮膚、牙齒、骨骼、關節內膠原蛋白的重要組成部分。本研究顯示p28結合Si-HAP細胞信號可明顯加快顱骨成骨能力。

綜上所述，摻雜Si的HAP負載BMP-2活性多肽修復材料是一種理想的生物支架、緩釋載體和修復材料〔22〕。但本研究尚為小樣本動物實驗，其結果外推到人體尚存在一定的不確定性，并且對于Si是如何提高HAP性能等機制尚未闡明。

4 參考文獻

1Costa JJ,Passos MJ，Leit?o CC,etal.Levels of mRNA for bone morphogenetic proteins，their receptors and SMADs in goat ovarian follicles grown in vivo and in vitro〔J〕.Reprod Fertil Dev,2012;24(5):723-32.

2Saito A，Suzuki Y,Kitamura M，etal.Repair of 20 film long rabbit radial bone defects using BMP-derived peptide combined with an alpha-tricalcium phosphate scaffold〔J〕.J Biomed Mater Res A,2006;77(4):700-6.

3Kirker-Head C，Karageorgiou V，Hofmann S，etal.BMP-silk composite matrices heal critirally sized femoral defects〔J〕.Bone，2007;41(6)：247-55.

4Saito A，Suzuki Y,Ogata S，etal.Activation of osteo-progenitor cells by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogenetic protein-2 knuckle epitope〔J〕.Biochim Biophys Acta,2003;1651(1-2)：60-7.

5Tsumaki N,Yoshikawa H.The role of bone morphogenetic proteins in endochondral bone formation〔J〕.Cytok Growth Factor Rev,2005;16(3):279-85.

6Kim IS,Song YM,Cho TH,etal.In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation〔J〕.Dev Growth Differ,2008;50(7):553-64.

7王莉麗, 王秀峰, 江紅濤, 等. 鈦摻雜對羥基磷灰石燒結穩定性和晶粒尺寸的影響〔J〕.功能材料，2015；19(46):19052-5.

8Xu L，Lv KG，Zhang WJ,etal.The healing of critical-size calvarial bone defects in rat with rhPDGF.BB，BMSCs，and 13-TCP scaffolds〔J〕.J Mater Sci Mater Med,2012；23(4):1073-84.

9Shen JY,Chart Park MB，He B，etal.Three-dimensional microchannels in biodegradable polymeric films for control orientation and phenotype of vascular smooth muscle cells〔J〕.Tissue Eng,2006;12(8):2229-40.

10Rose FR,Oreffo RO.Bone tissue engineering:hope vs hype〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2002;292(1):1-7.

11LeGeros RZ.Properties of osteoconductive biomaterials:calcium phosphates〔J〕.Clin Orthop Relat Res,2002;39(5):81-98.

12Yuan Q,Lu HW,Tang S,etal.Ectopic bone formation in vivo induced by a novel synthetic peptide derived from BMP-2 using porous collagen scaffolds〔J〕.J Wuhan Univ Technol,2007;32(3):701-5.

13Urist MR.Bone:formation by autoinduction〔J〕.Science,1965;150(698):893-9.

14Han DK，Kim CS，Jung UW,etal.Effect of a fibrin fibronectin sealing system as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-4 on bone formation in rat calvarial defects〔J〕.J Periodontol，2005;76(12)：2216-22.

15Urist MR,Mikulski A,Lietze A.Solubilized and insolubilized bone morphogenetic protein〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,1979;76(4):1828-32.

16Li JF,Lin ZY,Zheng QX,etal.Bone formation in ectopic and osteogenic tissue induced by a novel BMP-2-related peptide combined with rat tail collagen〔J〕.Biotechnol Bioprocess Engineer,2010;15(2):725-32.

17Lin ZY,Duan ZX,Guo XD,etal.Bone induction by biomimetic PLGA-(PEG-ASP)n copolymer loaded with a novel synthetic BMP-2-related peptide in vitro and in vivo〔J〕.J Control Release,2010;144(2):190-5.

18Li JF,Liu ZY,Zheng QX,etal.Repair of rabbit radial bone defects using true bone ceramics combined with BMP-2-related peptide and type I collagen〔J〕.Mater Sci Engineer C,2010;30(2):1272-9.

19Li JF,Liu ZY,Zheng QX,etal.Repair of rat cranial bone defects with nHAC/PLLA and BMP-2-related peptide or rhBMP-2〔J〕.J Orthop Res,2011;23(6):1745-52.

20徐靖宏.rhBMP-2復合載體骨骼肌異位成骨修復下頜骨缺損探討〔D〕.上海：上海第二醫科大學，2003.

21段智霞,鄭啟新,郭曉東,等.BMP-2活性多肽體外定向誘導大鼠BMSCs向成骨方向分化的實驗研究〔J〕.中國矯形外科雜志， 2007；15(21):1647-50.

22Tang S,Zhao J,Xu S,etal.Bone induction through controlled release of novel BMP-2-related peptide from PTMC11-F127-PTMC11hydrogels〔J〕.Biomed Mater,2012;7(1):015008.