阻斷神經元CD200表達誘導的炎性反應相關炎癥通路

劉宏斌 房艷宇 韓 鋼 潘云志 趙吉波 王 澍 張晨昕

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

帕金森病(PD)并非單因素所致，而是多因素交互作用下導致黑質多巴胺神經元大量變性、丟失〔1,2〕。然而，神經元也表達多種起著保護作用的免疫球蛋白〔3,4〕。CD200廣泛表達于包括神經元在內的多種細胞中，研究表明，CD200-CD200R通路是中樞神經系統內下調神經元/小膠質細胞活化的重要機制〔5,6〕。近年來與兩者活化可能相關炎癥通路的研究成為熱點，然而大部分研究均關于小膠質細胞活化相關的炎癥通路，而關于神經元變性過程中相關炎癥通路的研究較少。本實驗在體外采用PC12細胞代替神經元，探討在神經元發生炎性變性過程中可能相關的下游通路。

1 材料及方法

1.1細胞培養及分組 用含10%胎牛血清(FBS)的1640培養基(Hyclone，美國)培養PC12細胞(上海細胞庫)2～3 d傳代一次，待細胞貼壁達90%時，取對數期的細胞用于實驗。細胞分組：A：對照組；B：脂多糖(LPS)處理組；C：CD200抗體(Abcam公司，美國)及LPS(Sigma公司，美國)處理組；D：SB203580及CD200抗體處理組；E：AG490及D200抗體處理組。

1.2免疫熒光檢測CD200的表達 96孔板培養PC12細胞，4%多聚甲醛固定15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉0.5 h，加入1∶1 000稀釋的CD200過夜，熒光二抗孵育1.5 h，每步驟之間均用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察細胞形態及CD200的表達。

1.3酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細胞介素(IL)-6的分泌 以非處理組上清作對照，設立復孔，重復3次實驗，按照TNF-α(R&D)及IL-6(R&D)的使用說明書,96孔板中分別加入標準樣品及待測樣本、生物標記二抗及酶標試劑，37℃，反應1 h后洗板5次，加入顯色劑A、B，37℃敷箱中顯色10 min，加終止液，以酶標儀檢測波長為450 nm的光密度值。

1.4Western印跡檢測P38絲裂原激活蛋白激酶(P38MAPK)、酪氨酸激酶-信號轉導子與轉錄激活子(JAK-STAT3)、pho-P38MAPK及pho-JAK-STAT3的表達 收集A、B、C組細胞，提蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法用PAGE蛋白上樣緩沖液配制待測蛋白，上樣電泳，冰上轉膜，5%BSA封閉1 h，敷一抗P38MAPK(1∶1 000稀釋,cellsignal)、pho-P38MAPK(1∶1 000稀釋，cellsignal)，pho-JAK-STAT3(1∶1 000稀釋，Abcam)，JAK-STAT3(1∶1 000稀釋，CST)，4℃過夜，TBST洗膜，二抗孵育2 h，電化學發光法(ECL)發光。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0及Image J軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1PC12細胞表面CD200的表達 熒光顯微鏡觀察PC12細胞為單層貼壁細胞，胞體細長呈梭形，發出較多分支，表明CD200可表達于PC12細胞表面，見圖1。

圖1 PC12細胞表面CD200的表達(×20)

2.2PC12細胞炎癥因子分泌水平 在不加任何處理因素的情況下TNF-α及IL-6均有基礎分泌分別為〔(277±3.7)、(295±4.7)ng/L〕，單加LPS后細胞活化，兩者分泌增多〔分別為(324±7.2)、(357±9.2)ng/L〕，而用CD200抗體及LPS處理后較單獨的LPS處理而言，細胞活化更加明顯，TNF-α、IL-6分泌繼續增多〔分別為(398±5.7)、(395±7.7)ng/L〕，各組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3PC12細胞炎癥通路蛋白表達水平 兩種磷酸化蛋白及半定量分析待測蛋白與內參比而言，C組顯著高于B組及A組，說明在CD200抗體及LPS共刺激PC12細胞后P38MAPK及JAK-STAT3的磷酸化表達顯著增加，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2，表1。

圖2 各組PC12細胞炎癥通路蛋白表達

表1 各組炎癥通路蛋白表達水平比較

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

2.4兩條通路阻斷劑對炎癥因子水平的影響 與C組TNF-α、IL-6水平〔(384±5.2)、(396±4.8)ng/L〕比較，D組〔(341±4.5)、(353±4.2)ng/L〕和E組〔(375±2.7)、(378±2.9)ng/L〕明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)。加入足量的兩條通路阻斷劑后，TNF-α、IL-6分泌均有所減低，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明pho-P38MAPK及pho-JAK-STAT3通路均參與了CD200抗體及LPS誘導的神經元細胞的激活。

3 討 論

PD是常見的神經系統變性疾病，在我國，65歲以上的人群總體患病率為1 700/10萬，與歐美國家相似，其發病率隨著年齡的增高而升高，男性高于女性〔7～9〕。病理及尸檢結果表明，黑質多巴胺能神經元大量變性丟失，神經系統內的炎性反應參與了PD的發生及進展〔10,11〕，CD200廣泛表達在神經元、B細胞等細胞表面，而其受體CD200R則局限表達在小膠質細胞等髓樣細胞表面，兩者其一發生改變均可導致神經元及小膠質細胞的活化。本實驗證實PC12細胞存在CD200的表達。眾所周知，神經炎癥在神經變性疾病中發揮重要作用〔12〕，探討一種維持CD200/CD200R通路的平衡進而維持神經元及小膠質細胞處于靜息狀態的治療手段，必然會成為未來治療與神經炎癥有關的神經變性性疾病的新方向。

4 參考文獻

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