益坤寧對圍絕經期大鼠卵巢雌激素受體、caspase-3及細胞凋亡率的影響

杜文霞

(河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院婦產科，河南 鄭州 450002)

圍絕經期綜合征是婦女在圍絕經期由于雌激素分泌減少導致的一系列癥狀的癥候群〔1～3〕，常用治療方法為雌激素替代療法，以緩解其圍絕經期癥狀，療效已得到肯定，但易增加子宮出血、子宮內膜癌、乳腺癌的發生率〔4，5〕。祖國中醫認為發生圍絕經期綜合征的主要原因是腎虛、肝郁、脾虛。中藥益坤寧是一種由多味中藥材熬制而成的中藥制劑，具有補腎、疏肝、健脾的功效，能顯著改善圍絕經期綜合征的相關癥狀〔6〕。本研究擬探討益坤寧對圍絕經期大鼠卵巢雌激素受體(ER)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3及細胞凋亡率的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取30只13～14月齡雌性Wistar大鼠，體重290～328 g，平均(311.4±11.7)g；另選取10只5月齡且有規律動情周期的雌性Wistar大鼠，體重176～209 g，平均(194.6±6.8)g。飼養環境溫度20℃，濕度58%，每天給予12 h光照時間，自由飲食飲水。實驗大鼠均由河南省中醫院提供，合格證號：SYXK(豫)2016-0009。

1.2實驗試劑與儀器 TUNEL試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色液、Trizol試劑購自羅氏公司，蛋白酶K、3%H2O2、轉化劑POD購自北京中杉金橋生物技術有限公司，caspase-3、ERα、ERβ抗體均購自美國Santa Cruz公司，光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3藥劑制備 中藥益坤寧主要成分：熟地30 g、黃芪30 g、山茱萸30 g、柴胡15 g、桂枝15 g、牡蠣30 g、麥冬20 g、當歸20 g、甘草15 g、白芍20 g、龍骨30 g、茯苓20 g。所有藥材經專家鑒定均符合中國藥典2005年版的規定，將其制成水煎劑，高壓密封后備用。

1.4建模及分組 30只13～14月齡大鼠經過連續15 d的陰道脫落細胞涂片檢查確定存在動情周期紊亂、動情周期延長的現象，可作為圍絕經期大鼠模型；按照隨機數字表法分為模型組(10只)、替勃龍片(利維愛)組(10只)、益坤寧組(10只)。5月齡的大鼠納入對照組(10只)。益坤寧組每天給予益坤寧1.12 g/kg，利維愛組每天予利維愛(荷蘭N.V.Organon，注冊證號：H20160575，規格：2.5 mg)0.26 g/kg，模型組和對照組每天予3 ml生理鹽水。四組大鼠均連續灌胃給藥4 w。

1.5細胞凋亡測定 在末次給藥后1 d將所有大鼠斷頭處死，取出雙側卵巢，取部分卵巢組織置入4 %多聚甲醛中固定，進行常規的石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況。二甲苯脫蠟處理，無水乙醇5 min、90%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸餾水2 min，滴加20 μg/ml蛋白酶K(10 mmol/L Tris，HCl稀釋)，在室溫下放入濕盒中作用15～ 30 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min。在切片上滴加50 μl新鮮配制 TUNEL反應混合物，在室溫下放入濕盒中作用孵育1 h。PBS沖洗3次，每次5 min。3%H2O2甲醇液室溫阻斷10 min，室溫孵育90 min，在切片上滴加50 μl POD，在室溫下放入濕盒中作用30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，蘇木素復染。梯度乙醇中行常規脫水，二甲苯透明處理，滴加少量中性樹膠，封片晾干。采用光學顯微鏡進行觀察，細胞核呈棕黃色者為陽性凋亡細胞，細胞核呈藍色者為陰性非凋亡細胞。采用JD-801顯微圖像分析系統進行圖像采集，并分析細胞凋亡率。細胞凋亡率=染色陽性面積/視野總面積×100%。

1.6逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測各組大鼠caspase-3、ERα、ERβ mRNA表達 采用Trizol試劑提取卵巢組織中的總RNA，采用紫外可見分光光度計測定吸光度OD260 。取2.5 μg總RNA進行反轉錄合成cDNA第一鏈。采用Gene Runner軟件設計大鼠caspase-3、ERα、ERβ的引物序列。caspase-3上游引物：5′-TCTGACTGGAAAGCCGAAACTC-3′，下游引物：5′-ACGGGATCTGTTTCTTTGCATG-3′，長度341 bp；ERα上游引物：5′-ACCAAAGCCTCGGGAATG-3′，下游引物：5′-GCTCGTTCTCCAGGTAGTAGGG-3′,長度403 bp；ERβ上游引物：5′-GAGCTCAGCCTGTTGGACC-3′，ERβ下游引物：5′-GGCCTTCACACAGAGATACTCC-3′，長度246 bp。以β-actin為內參，上游引物：5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物：5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，長度511 bp。PCR 擴增：(1)變性：94℃，1 min ；(2)退火：55℃，1 min；(3)延伸：72℃，1 min。將擴增產物置于1.5%瓊脂糖中進行凝膠電泳，GIS凝膠成像系統分析電泳條帶。caspase-3、ERα、ERβ的相對表達量以其與β-actin灰度比值表示。

1.7蛋白印跡法檢測各組大鼠caspase-3、ERα、ERβ蛋白表達 提取大鼠卵巢總蛋白,取適量樣品，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移于聚偏二氟乙烯膜上，加入3%BSA封閉60 min，加入稀釋好的一抗(caspase-3、ERα、ERβ)，37℃孵育60 min。TTBS緩沖液清洗3 次，每次10 min，TBS洗膜10 min。加入用ALP標記的IgG，37℃孵育1 h，用TTBS緩沖液清洗3 次，每次10 min，TBS洗膜10 min。GIS凝膠成像系統分析電泳條帶，采用β-actin作為內參。caspase-3、ERα、ERβ蛋白表達水平以其與β-actin灰度比值表示。

1.8統計學方法 應用SPSS19.0軟件行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1四組細胞凋亡率比較 四組細胞凋亡率整體比較差異有統計學意義(P<0.05)。益坤寧組〔(9.24±1.61)%〕、利維愛組〔(9.13±1.42)%〕、對照組〔(9.26±1.28)%〕顯著低于模型組〔(17.96±3.67)%〕(P<0.05)；益坤寧組、利維愛組、對照組兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2四組卵巢組織caspase-3、ERα、ERβ mRNA比較 四組卵巢組織caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白水平整體比較差異有統計學意義(P<0.05)。益坤寧組、利維愛組、對照組的caspase-3 mRNA及蛋白水平顯著低于模型組，ERα、ERβ mRNA及蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05)；益坤寧組、利維愛組caspase-3、ERα、ERβ mRNA均高于對照組，caspase-3蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)；益坤寧組和利維愛組caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組卵巢caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白比較

與模型組比較：1)P<0.05；與對照組比較：2)P<0.05

3 討 論

圍絕經期婦女的卵巢功能明顯衰退，雌激素分泌減少分，血液中雌激素濃度也明顯降低，促卵泡激素(FSH)和黃體生成激素(LH)升高，導致下丘腦-垂體-卵巢軸之間出現失調，對自主神經中樞及其控制的各臟器功能造成影響，從而導致一系列自主神經功能失調的癥狀出現〔7，8〕。利維愛是一種具有弱雌激素、雄激素和孕激素活性的甾體激素，能明顯抑制圍絕經期婦女血漿中促卵泡激素水平，對黃體生成素抑制較輕，常用于治療圍絕經期綜合征〔9〕。中藥益坤寧具有補腎、疏肝、健脾的功效，可調節生殖內分泌系統，改善卵巢功能。相關研究顯示,卵巢功能衰退時卵泡中大量顆粒細胞發生凋亡,這可能是引起卵泡閉鎖 、卵泡發育停止的重要因素。卵巢功能衰退的嚴重程度與卵巢內細胞凋亡率顯著相關〔10〕。結合結論可以推斷，中藥益坤寧具有預防和延緩卵巢內顆粒細胞凋亡的作用，阻止卵泡閉鎖，獲取更多卵泡，進而增加雌激素的分泌量，這可能是益坤寧治療圍絕經期綜合征的機制之一。在細胞凋亡中caspase家族具有重要的作用，caspase-3是凋亡過程中最關鍵的功能蛋白酶，在整個凋亡過程中會多次被激活，同時可以激活下游的細胞死亡蛋白酶。在細胞凋亡末期的細胞裂解及凋亡小體形成的過程中，caspase-3必不可少〔11〕。由本研究結果可以推斷，益坤寧可對圍絕經期大鼠卵巢中caspase-3基因的轉錄和翻譯起到抑制作用，進而降低caspase-3功能蛋白酶的表達,達到抑制卵巢細胞凋亡的目的。圍絕經期最大的變化就是雌激素分泌減少，雌激素通過與ER結合發揮其生物作用，因此ER的數量能直接影響雌激素發揮作用的大小。ER主要有ERα、ERβ兩組亞型，它們在人體內廣泛分布。ERα、ERβ對于維持卵巢正常功能是必不可少的，對卵泡、卵母細胞的發育和成熟具有重要的作用〔12〕。本研究顯示益坤寧能上調圍絕經期大鼠卵巢中ERα、ERβ的表達，進而加強雌激素效應，減緩卵巢衰退。

4 參考文獻

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