采收期谷物中真菌毒素產毒菌的篩選鑒定

裴世春，李 妍，高建偉，王 巖，王 琳，韓基東

（1.通化師范學院食品科學與工程學院，吉林 通化 134002；2.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.普菲特益斯生物科技（北京）有限公司，北京 101111；4.嶺南大學生命應用科學學院，韓國 大邱 38541）

真菌毒素是真菌在一定的條件下分泌的有毒二次代謝產物，主要是由Fusarium sp.、Penicillium sp.和Aspergillus sp.中的部分產毒真菌代謝所產生，其中常見的真菌毒素主要包括玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素、伏馬毒素B1（fumonisin B1，FB1）、伏馬毒素B2（fumonisin B2，FB2）、橘青霉素、展青霉素（patulin，Pat）、黃曲霉毒素B1（afulatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）和赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）等10余種[1-3]。

從國內外的研究結果可知[2-3]，各種糧食作物、水果蔬菜和加工食品中均有不同程度的真菌及真菌毒素的污染，其中糧食作物中真菌毒素的污染普遍較為嚴重，因此世界多數國家和地區均制定了嚴格的真菌毒素法定殘留限量標準，我國也在最新實施的食品安全國家標準GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中對ZON、DON、Pat、AFB1、AFM1和OTA等真菌毒素在不同農產品及其加工制品中的殘留限量進行了設定[4]，該標準的出臺不僅保障了我國農產品及其加工制品的安全性，同時也為我國農產品中真菌和真菌毒素污染相關的基礎性調查研究提供了相關標準。

東北地區是我國主要的商品糧生產基地，該地區生產的商品糧安全性關系到全國消費者的飲食安全，特別是東北地區采收期間谷物是否污染有產毒性真菌，對后期商品糧的儲藏、運輸和加工中的安全性具有決定性的影響，因此有必要對東北地區采收期間谷物中的產毒性真菌開展調查研究。

本實驗將利用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯用技術和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）為分析工具，通過篩選和鑒定東北地區采收期間小麥、玉米和水稻中的產毒性真菌，分析東北地區采收期糧食中潛在的真菌毒素安全風險，以期為相關部門針對性的制定真菌危害防控措施和風險評估提供基礎性資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥、玉米和水稻東北糧食種植區采收期間田間采集；ZON、AFB1、FB、DON 美國Sigma公司；真菌毒素檢測ELISA試劑盒 普菲特益斯生物科技（北京）有限公司；DNA提取試劑盒 杭州博日科技有限公司；DNA Marker、正反引物、蛋白酶K、Agarose M、1×TE等 生工生物工程（上海）股份有限公司；10×Buffer、dNTP、Taq酶 寶生物工程（大連）有限公司；PDA培養基 天津凱通化學試劑有限公司；其他化學試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

2720 Theraml Cycler PCR擴增儀 美國Applied Biosystems公司；UPLC-MS/MS聯用儀（LC-30A色譜與LCMS-8040三重四極桿質譜聯用系統（配置LC-30AD×2輸液泵、DGU-20A5在線脫氣、SIL-30AC自動進樣器、CTO-30A柱溫箱、CBM-20A系統控制器、LabSolutions Ver. 5.50色譜工作站）） 日本島津公司；VICTOR X4多功能酶標儀、Wahser 400 96 孔洗板機 美國GE公司；超濾杯、超純水系統 美國密理博公司；WP25AB臺式電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；WD-9413A凝膠成像分析儀、DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鐮刀菌分離

樣品根據GB 4789.1—2010《食品微生物學檢驗 總則》[5]中樣品的采集規則進行采樣。于2016年10月采集東北三省糧食種植區的小麥、玉米和水稻樣品共300 份。每份小麥、水稻和玉米樣品中隨機選取50～100 粒，分別放入50 mL的離心管內，加入20～30 mL的體積分數75%乙醇溶液表面消毒1 min后將離心管內的乙醇倒掉，無菌水重復清洗4 次，將清洗消毒好的樣品，放置于無菌濾紙上干燥，干燥好的樣品放到滅菌，馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板培養基中，25 ℃恒溫培養，挑選長出的菌絲無菌接種到新的PDA培養基上，25 ℃的恒溫培養，經多次反復分離，直至菌絲純化后4 ℃保存待用。

1.3.2 基于ELISA的產毒菌初篩

將純化菌絲無菌接種到10 mL滅菌PSC（peptone sucrose Czapek）培養基（蔗糖30 g、硝酸鉀0.75g、酵母浸出膏0.5 g、蛋白胨10 g、硝酸鈉3.0 g、硫酸鎂0.25 g、磷酸氫二鉀0.5 g、氯化鉀0.25 g、硫酸鐵0.012 5 g、500 mL蒸餾水）中，120 r/min，25 ℃的恒溫振蕩箱中培養14 d后進行高溫滅菌，滅菌培養基利用Whatman No. 1濾紙過濾后，濾液離心取上清液，稀釋后利用ELISA試劑盒篩選陽性樣品。

1.3.3 基于LCMS-8040三重四極桿質譜儀的產毒性能定性分析

經ELISA初篩陽性的PSC培養基用正己烷和石油醚進行脫脂，脫脂菌液用苯（1∶1，V/V）為萃取劑萃取3 次，合并萃取液旋蒸至干后用甲醇定容，UPLC-MS/MS儀進行定性檢測。

色譜柱：Shim-pack XR-ODS III（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）；流動相：A為0.02%乙酸和2 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流速0.3 mL/min；進樣體積3 μL；柱溫40 ℃；梯度洗脫 0～1 min 20% B，1～11 min 35% B，11～13 min 50% B，13～14 min 50% B，14～18 min 95% B，18～20 min 95% B，20～21 min 10% B，21～21.1 min 20% B。

離子源：電噴霧電離，正負離子掃描；干燥氣：氮氣，流速15 L/min；離子源接口電壓：4.5～3.5 kV；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：450 ℃；掃描模式：多反應監測；駐留時間：10 ms。

1.3.4 基于PCR的產毒菌鑒定

基于PCR的產毒菌鑒定參照White[6]和Pei[7]等方法調整后進行，具體是將產毒菌提取DNA后，采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進行擴增，PCR體系為25 μL，所需試劑及用量如表1所示。反應條件為：95 ℃預變性 3 min，94 ℃變性40 s，各組引物53 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，進行35 個循環，最后72 ℃延伸7 min。凝膠電泳檢測PCR產物：用1.0×TAE電泳緩沖液制備1.0%的瓊脂糖凝膠，將8 μL PCR產物加入到對應的凝膠孔中，另在一孔加入適量的DNA分子質量標記物，電泳后凝膠成像系統中觀察PCR產物片段。

PCR產物由吉林省庫美生物科技有限公司測序。測序結果在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中使用BLAST程序進行比對。

表1 PCR所需試劑及用量Table 1 Volumes of reagents used for PCR reaction

2 結果與分析

2.1 基于ELISA的產毒陽性菌初篩

通常真菌毒素的定性定量測定方法有薄層色譜、HPLC、氣相色譜以及UPLC-MS/MS聯用等方法[8-11]，雖然色譜的方法具有精確可靠的優勢，但是色譜方法通常需要進行真菌毒素的有機溶劑提取、濃縮、過柱和純化等處理過程，對大量分離菌的培養液進行檢測時需要耗費大量的樣品前處理時間和前處理費用，而基于抗原抗體特異性反應的ELISA的方法篩選產毒性陽性菌的過程中可以省略繁瑣的前處理過程，直接將培養液進行適當稀釋后進行高通量檢測[12-17]。

因此，本實驗是采用ELISA試劑盒對采集的300 份谷物樣品中分離出的菌進行了產毒性檢測，其結果如圖1所示，基于ELISA共初篩出73 株產毒陽性真菌，其中以產DON為主的陽性菌株有51株，產毒性在1.4～190.0 ng/mL之間，產ZON為主的菌株16 株，產毒性在4.9～161.3 ng/mL之間，產FB為主的陽性菌株6 株，產毒性在5.0～97.4 ng/mL之間，AFB1產毒菌沒有篩選到。

圖1 真菌毒素產毒性陽性真菌的ELISA初篩Fig. 1 Screening of positive mycotoxin-producing strains by ELISA

李妍等[18]對糧食樣品中ZON的ELISA檢測方法和UPLC法比較研究結果表明，ELISA檢測為陰性的樣品利用UPLC-MS/MS方法檢測100%為陰性，而ELISA檢測為陽性的樣品中經UPLC-MS/MS法鑒定也有近60%的假陽性；余容等[19]對比國內外DON檢測試劑盒的實驗也顯示ELISA的檢測結果數據普遍高于HPLC的檢測結果；劉師文等[20]對FB1的ELISA和HPLC檢測方法對比結果表明，二者雖然具有良好的相關性，但是針對同一個陽性樣品，ELISA的檢測數據普遍高于HPLC的檢測數據。分析以上研究結果可知ELISA檢測方法假陽性率較高，但是基于這一點，可以利用ELISA檢測結果排除陰性樣品方面卻具有良好的可行性，因此，本實驗中分離菌的液體培養樣品中利用ELISA檢測為產毒性陰性的分離菌均判斷為不產真菌毒素的菌株，實驗中免去了后續進一步鑒定和分析的步驟，加快了產毒菌的篩選效率，對ELISA篩選出的陽性樣品則通過質譜進行了進一步的陽性驗證。

2.2 基于LC MS-8040三重四極桿質譜儀的陽性分離菌的驗證

為了應用LC MS-8040三重四極桿質譜儀進一步驗證ELSIA初篩陽性菌的產毒性，首先對DON、ZON、FB和AFB1等真菌毒素標準物質進行了定性測定，其結果如圖2所示。DON出峰時間為2.152 min，AFB1出峰時間為13.955 min，FB1出峰時間為16.343 min，FB2出峰時間為17.351 min，ZON出峰時間為17.272 min，分離效果良好，可以同時精確定性分析5 種真菌毒素。

圖2 標準毒素MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of standard toxins

表2 LC MS-8040三重四極桿質譜驗證分離菌的產毒性Table 2 Identification of mycotoxin-producing strains by LC-MS/MS

利用LC MS-8040三重四極桿質譜儀對ELISA篩選出的73 株產毒性陽性菌進行驗證分析結果如表2所示，共驗證出6 株分離菌產DON毒素，其中有4 株分離菌產DON的同時也產ZON毒素，有一株分離菌產FB毒素。

本實驗篩選經LCMS-8040-三重四極桿質譜儀驗證的陽性菌株顯著小于ELISA分離的陽性菌株，這一結果進一步說明了ELISA檢測結果雖然靈敏度高，但是在痕量真菌毒素檢測中極易產生假陽性，另外，由于本實驗是從幾百份谷物樣品中分離真菌，分離菌的數量龐大，無法在短時間內采用固體培養基培養法制備富集高濃度的樣品后進行產毒性UPLC-MS/MS分析，因此利用試管小量液體培養分離菌后經提取進行的質譜分析有可能因液體培養過程中受到基質等因素影響[21]以及分泌的毒素含量過低而未能檢測出分泌微量真菌毒素的產毒菌。即便如此，也能聯合運用ELISA和LCMS-8040三重四極桿質譜方法能夠從大量分離菌中快速篩查到產毒性真菌，因此，該方法適用于高產毒性真菌的分離篩選，該方法體系對快速判斷采收期谷物中是否污染有產毒性真菌，進而對采收的谷物運輸、儲藏和加工之前采取安全相關措施具有良好的實用價值。

2.3 基于PCR的產毒菌鑒定

PCR技術可以在真菌的鑒定過程中減少鑒定難度，是具有良好應用前景的技術方法，眾多研究者[22-25]都對基于PCR技術的產毒性菌株的鑒定給予了良好的評價。

圖3 利用ITs1和ITs4引物進行PCR擴增鐮刀菌的電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplified roducts from Fusarium using ITs1 and ITs4 primers

本實驗利用通用引物ITS1、ITS4擴增了菌的基因組DNA，其擴增產物DNA條帶如圖3所示，DNA片段大小為520 bp左右，并且擴增產物條帶單一且清晰可見，擴增產物進行測序后利用BLAST進行了基因序列比對，結果如圖4、表3所示，所測定的菌與美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中相應菌株的相似度均超過99%，進而可以判斷本實驗的分離菌分別為F. asiaticum、F. graminearum、F. poae和F. fujikuroi。

圖4 F. poae（a）、F. asiaticum（b）、F. graminearum（c）和F. fujikuroi（d）測序結果比對Fig. 4 Comparison of sequencing results among F. poae (a),F. asiaticum (b), F. graminearum (c) and F. fujikuroi (d)

表3 所測菌株基因序列與基因庫中現有序列比對結果Table 3 Comparison of the sequences of the tested strains with GenBank sequences

綜合表2、3可知，本實驗采集的東北地區采收期糧食中產DON和ZON的產毒菌種類經鑒定為F. asiaticum、F. graminearum、F. poae和F. fujikuroi等鐮刀菌屬菌株，其中分離的F. asiaticum和F. graminearum與史文琦等[26]的分析結果類似，均具有DON的產毒性能，說明我國DON產毒菌主要包括了F. asiaticum和F. graminearum。本實驗分離的F. poae具有同時產DON和ZON的性能，而張楓等[27]分離的F. poae為產T-2毒素的產毒菌，由于本實驗沒有進行T-2毒素的檢測，因此本實驗中分離的F. poae是否同時具有T-2毒素產毒性還有待進一步驗證。考慮到王晉等[28]也在小麥中分離出F. poae菌株，雖然沒有進行產毒菌的測定，但是可以推測F. poae菌株也是我國糧食中常污染的鐮刀菌之一。研究[29-30]表明，F. fujikuroi是產FB毒素的主要產毒菌之一，本實驗調查中分離的C-130507-3-3菌株經與NCBI中相應菌株比對結果與F. fujikuroi真菌相同，同時經UPLC-MS/MS方法鑒定，該菌具有FB毒素的產毒性，由此可知，我國東北采收期糧食中污染有產FB毒素的產毒菌。

3 結 論

本實驗利用ELISA的快速篩選和UPLC-MS/MS的精密鑒定的優勢，結合PCR技術，通過基因比對發現我國東北地區糧食主產區采收期的小麥、玉米和水稻中存在一定的產DON、ZON和FB毒素的產毒性真菌污染，并成功分離鑒定了6 個產毒菌，由此可知，東北地區糧食主產區糧食具有潛在的真菌毒素污染的可能性，如果采收后的糧食在儲藏、運輸和加工過程中管理不善，將會危害糧食的安全性，因此，后期有必要持續跟蹤開展采收后的糧食在儲藏、運輸和加工過程中真菌的生長情況和真菌毒素風險評估，同時也需要制定針對性的安全控制措施。

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