HPLC法測定阿達帕林凝膠中阿達帕林有關物質

朱雅蓮 肖學成 崔開宇 王曉飄

[摘要]目的 建立測定阿達帕林凝膠中阿達帕林有關物質的高效液相色譜法。方法 采用色譜柱 ORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，以冰醋酸-水（0.1∶100）為流動相A，以乙腈-四氫呋喃（65∶35）為流動相B，進行梯度洗脫，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃，進樣量為100 μl，流速：1.2 ml/min。結果 阿達帕林與各雜質分離度良好，阿達帕林凝膠溶液在12 h內穩定，雜質A、B、C、D的定量限分別為0.38、0.56、3.75、1.5 ng；檢測限分別為0.11、0.17、1.12、0.45 ng。阿達帕林在0.0225～0.1125 μg/ml 的濃度范圍內峰面積與濃度呈良好的線性關系，回歸方程為y=9.9714x+0.003906（r=0.9998）。結論 此方法測定阿達帕林凝膠中阿達帕林有關物質簡單可行。

[關鍵詞]阿達帕林凝膠；阿達帕林；高效液相色譜法；有關物質

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）3（c）-0020-05

[Abstract]Objective To establish the HPLC method for determination related substances of Adapalene in Adapalene Gel.Methods Chromatographic column ORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） was used，and the mobile phase A was glacial acetic acid-water （0.1∶100），and the mobile phase B was acetonitrile-tetrahydrofuran （65∶35） to conduct the gradient elution.The wavelength of detection was 270 nm，the temperature of column was 30°C，the sampling amount was 100 μl，and the flow rate was 1.2 ml/min.Results Adapalene was well separated from various impurity.The solution of Adapalene Gel was stable in 12 hours.The limit of quantification of impurity A，B，C and D was 0.38 ng，0.56 ng，3.75 ng and 1.5 ng respectively，and the detection limit was 0.11 ng，0.17 ng，1.12 ng and 0.45 ng.Adapalene showed a good linear relationship between peak area and concentration in the concentration range of 0.0225-0.1125 g/ml，and the regression equation was y=9.9714x+0.003906 （r=0.9998）.Conclusion This method is simple and feasible to determine the related substances of Adapalene in Adapalene Gel.

[Key words]Adapalene Gel；Adapalene；HPLC；Related substances

痤瘡是一種常發于顏面部的皮膚病，發病率高，青少年中常見，目前仍未找到有效的根治方法，臨床上常用藥物治療，一般為局部給藥和口服給藥，由于口服治療的藥物均有不同程度的不良反應[1]，因此，臨床上主要采用外治法進行治療[2]。阿達帕林屬于第三代維A酸類藥物，對受體的選擇性強，不良反應小，在較低的濃度下可達到治療效果[3]，是外用維A酸類治療痤瘡的一線選擇藥物[4]。常見的劑型為凝膠劑。阿達帕林凝膠最先由法國高德美國際公司生產，商品名為達芙文。該藥具有較強的抗炎作用，同時可以調節毛囊口角質，形成細胞的分化和增殖，此外還具有抑制皮脂分泌等作用[5]。臨床上用于治療尋常型痤瘡，其治療效果優于硫磺制劑、過氧苯甲酰凝膠，與他扎羅汀總療效相似，不良反應較輕[6]。同時有研究表明，阿達帕林凝膠聯合其他藥物和方法不僅可以治療輕中度痤瘡[7-9]，對治療跖疣、泛發性扁平疣和毛周角化癥也有很好的療效[10-13]。由于《中國藥典》并未收載阿達帕林及制劑的質量標準，EP8.0版和USP38版也只有原料藥的標準，因此，為了更好地保證藥品質量，通過參考EP8.0版標準[14]和USP38版標準中阿達帕林原料藥項下的有關物質檢測方法及其他相關文獻[15-17]，對阿達帕林凝膠中所含的有關物質進行檢查和控制。

1 儀器與試劑

1.1儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國戴安）和相應的工作站；AUW220D電子分析天平（日本島津）；CSH-1000GSD-1型綜合藥品穩定性試驗箱（重慶創測科技有限公司）；ORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 藥品與試劑

阿達帕林凝膠樣品（由武漢諾安藥業有限公司試制，批號為20170301、20170302、20170303，規格為0.1%）；空白輔料樣品（自制，除不含阿達帕林外，其他成分均與樣品一致）；市售阿達帕林凝膠（法國高德美國際公司，批號為5051139，商品名為達芙文）；阿達帕林對照品（歐洲藥典委員會提供，批號為00DCL6，含量為99.9%）；阿達帕林雜質A（EP）對照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批號為C4X-18091-1607，含量為97.7%）；阿達帕林雜質B（EP）對照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批號為C4X-18092-1702，含量為98%）；阿達帕林雜質C（EP）對照品（歐洲藥典委員會提供，批號為0004OG，含量為100.0%）；阿達帕林雜質D（EP）對照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批號為C4X-18093-1602，含量為98%）；乙腈、四氫呋喃為色譜純，其他試劑均為分析純；純化水。

2 方法與結果

2.1色譜條件

采用ZORBAX SB-Phenyl柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：以冰醋酸-水（0.1∶100）為流動相A，以乙腈-四氫呋喃（65∶35）為流動相B；檢測波長為270 nm；柱溫為30℃；流速1.2 ml/min；進樣量100 μl，梯度洗脫見表1。

2.2溶液的制備

2.2.1樣品溶液 取阿達帕林凝膠約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉移至10 ml量瓶中，用2 ml乙腈-四氫呋喃-水（37∶20∶43）（下稱稀釋劑）清洗燒杯2次，合并清洗液至量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液備用。

2.2.2對照溶液 精密量取“2.2.1”溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.3空白輔料溶液 取空白輔料樣品0.625 g，精密稱定，制備方法同“2.2.1”項下。

2.2.4系統適用性溶液 取阿達帕林和雜質A、B、C、D適量，加稀釋劑稀釋成含阿達帕林約為6.25 μg/ml和各雜質濃度為0.0375 μg/ml的混合溶液。

2.3專屬性考察

2.3.1 輔料的干擾試驗 取空白溶劑、空白輔料、原料藥溶液、自制凝膠溶液各100 μl進樣，記錄色譜圖（圖1），結果顯示空白溶劑、空白輔料對阿達帕林峰的檢測無干擾。

2.3.2 雜質的定位與分離 取阿達帕林雜質A、B、C、D、主成分藥阿達帕林溶液和系統適用性溶液分別進樣，記錄色譜圖（圖2），結果顯示，四個已知雜質對主成分的檢測并不干擾，且各雜質峰之間的分離度良好，證明此方法可有效分離阿達帕林與已知雜質。

2.4破壞性試驗

制劑酸破壞 取阿達帕林凝膠約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5ml，超聲使均勻分散，轉移至10 ml量瓶中，加入1 mol/L的鹽酸溶液l ml，搖勻，避光放置1 h后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml中和，再用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑堿破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉移至10 ml量瓶中，加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液l ml，搖勻，避光放置2 h后，用1 mol/L鹽酸溶液1 ml中和，再用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑氧化破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉移至10 ml量瓶中，加入30%的H2O2 1 ml，搖勻，避光放置23 h后，于80℃水浴中加熱2 min，冷卻至室溫，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑高溫破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉移至10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置100℃水浴中破壞2 h后，冷卻至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑光照破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉移至10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置4500Lx±500Lx的強光下照射0.5 h，搖勻，即得。

按上述色譜條件，分別取酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進樣，記錄色譜圖，見圖3～7，結果表明：①阿達帕林凝膠的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進樣，所產生雜質峰與主峰均能基線分離，各降解產物峰之間、各降解產物峰與主峰之間的分離度均符合規定；②阿達帕林凝膠在氧化條件和堿性條件下比較穩定，在高溫、光照和酸性條件下較為敏感。雜質含量的計算方法為面積歸一法。

2.5精密度試驗

取“2.2.4”項下的系統適用性溶液，在上述擬定的色譜條件下連續進樣6針。試驗結果表明，在該色譜條件下，主峰及各雜質峰的重復性好，阿達帕林與雜質A、B、C、D的峰面積分別為65.2543、0.5345、0.5345、0.0623、0.2180。RSD均<2.0%，滿足試驗要求。

2.6分離度試驗

由于雜質C 的保留時間與主藥阿達帕林的出峰時間最接近，因此主要考察阿達帕林峰與雜質C峰之間的分離度。取雜質C和阿達帕林適量加稀釋劑制成每毫升含阿達帕林約為6.25 μg/ml和雜質C濃度約為0.0375 μg/ml的混合溶液，在上述擬定的色譜條件下連續進樣6針。試驗結果表明，雜質C峰與主峰分離度的平均值為11.07（>4.5），RSD=1.42%，分離度符合要求。

2.7樣品溶液穩定性

取本品凝膠（批號20170301）按“2.2.1”項下的測定方法，新配制供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h進樣，記錄色譜圖，考察樣品溶液穩定性。結果，凝膠中雜質D峰面積的RSD=1.18 %（n=6），單雜峰面積的RSD=0.52%（n=6），主峰峰面積的RSD=0.07%（n=6），總雜峰面積的RSD=0.12%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下放置12 h穩定。

2.8定量限及檢測限的考察

取雜質A、B、C、D對照品溶液，經稀釋劑逐步稀釋，分別進樣進行測定，當信噪比（S/N）約為10左右時，雜質A、B、C、D的定量限分別為0.38、0.56、3.75、1.5 ng。當信噪比（S/N）≥3時，雜質A、B、C、D的檢測限分別為0.11、0.17、1.12、0.45 ng。

2.9線性關系的考察

精密稱取阿達帕林對照品適量，用稀釋劑溶劑稀釋，配成約為0.0225、0.03、0.0375、0.075、0.1125 μg/ml的線性系列標準溶液，按上述擬定的色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。以阿達帕林的濃度（C，μg/ml）為橫坐標，對應的峰面積（A）為縱坐標，以最小二乘法進行線性回歸方程計算及相關系數，方程式為y=9.9714x+0.003906（r=0.9998）。結果表明，在0.0225～0.1125 μg/ml的濃度范圍內，阿達帕林峰面積與濃度之間呈良好的線性關系。

2.10樣品測定

取批號為20170301、20170302、20170303三批樣品及市售樣品，按樣品溶液的配制方法，經上述確定色譜條件檢查，以主成分自身對照法計算雜質含量，結果見表4。

3 討論

3.1流動相條件的選擇

根據EP8.0版中阿達帕林原料藥項下的有關物質檢測方法測定的結果，其色譜條件對雜質A的檢出有影響，考慮到輔料峰與雜質A峰保留時間的重合，將色譜條件進行調整， 增加第一步梯度的時間，將原換相時間由2.5 min增加至10 min；同時，增加水相（流動相A）的比例，將比例由50%增高至60%，減小有機相（流動相B）的比例，由50%降低至40%，以增加雜質A峰與輔料峰的分離度。但是，改變條件后，在30～40 min之間有明顯的換相峰，這會影響其他雜質及主峰峰形，其原因可能是增加了第1步梯度的時間，并且縮短了第二步梯度換相時間，導致出現換相峰，因此，我們只增加了第一步梯度的時間，其他與EP8.0版有關物質檢測方法保持一致。流動相條件具體見“2.1”，按此條件測定，阿達帕林和各雜質的分離效果較好。

3.2進樣濃度的選擇

由于各國藥典并沒有收載阿達帕林凝膠的檢測方法，根據USP38版阿達帕林原料的有關物質的檢測方法，供試品的濃度為2.0 mg/ml，考慮到阿達帕林凝膠的規格為0.1%，若采用同一濃度進行試驗操作，即需取20 g凝膠置10 ml量瓶中，試驗操作無法進行。根據凝膠溶解后過濾的可操作性，最終將供試品溶液濃度確定為0.0625 mg/ml。

3.3進樣量的選擇

根據上述溶液濃度的改變，為了滿足系統適用性的試驗要求，即系統適用性溶液中雜質C峰的信噪比應>10，將進樣量由25 μl改變成100 μl。

4 小結

阿達帕林屬于第三代維A酸類藥物，對光較為敏感，結合相關的文獻[18-19]和本文的破壞性試驗，應于夜間使用，并且避光保存。

凝膠劑是近年來興起的一種新型制劑，方便易制[20]，相較于乳膏使用時的油膩感，凝膠劑更易被患者所接受。但是，由于凝膠常用卡波姆等高分子聚合物，在制備樣品溶液時會遇到過濾稍微困難的問題，目前還未找到合適的解決辦法。

藥物使用的不良反應與所含雜質的含量有密切的關系，因此有效控制雜質的含量對藥物的使用安全有著至關重要的作用。目前對阿達帕林凝膠的有關物質檢測方法并沒有一個很好的檢驗標準。本文通過HPLC法對阿達帕林凝膠中有關物質進行了系統的方法學研究，為研究制定阿達帕林凝膠有關物質質量標準提供了依據。

[參考文獻]

[1]孫欣榮，劉志宏，黃愛文，等.痤瘡發病機制及其藥物治療的研究進展[J].中國藥房，2017，28（20）：2868-2871.

[2]唐挺，賈敏，胡文韜，等.尋常痤瘡中藥外治研究進展[J].陜西中醫，2017，38（5）：679-680.

[3]張石革，宋菲.維A酸受體藥物的研究進展及皮膚科臨床應用評價[J].中國醫院用藥評價與分析，2002，2（1）：12-14.

[4]項蕾紅.中國痤瘡治療指南（2014修訂版）[J].臨床皮膚科雜志，2015，44（1）：52-57.

[5]龍福泉，王千秋.夫西地酸乳膏聯合阿達帕林凝膠治療尋常痤瘡的臨床觀察[J].中國皮膚性病學雜志，2012，26（7）：660-662.

[6]林潔，孫然第，鄭茹，等.0.1%阿達帕林凝膠治療尋常型痤瘡的臨床循證研究[J].中國麻風皮膚病雜志，2012，28（12）：839-843.

[7]張蕊.紅藍光聯合阿達帕林凝膠治療輕、中度痤瘡的有效性和安全性分析[J].醫學理論與實踐，2015，28（1）：21-22.

[8]石麗君，黃小雄，黃克，等.甘草鋅顆粒聯合克拉霉素及阿達帕林凝膠治療中度尋常型痤瘡的臨床觀察[J].皮膚性病診療學雜志，2014，21（2）：138-140.

[9]蔡志強，楊敷，榮光輝.阿達帕林凝膠聯合阿奇霉素間歇沖擊療法治療中重度尋常型痤瘡的臨床觀察[J].皮膚性病診療學雜志，2013，20（2）：109-111.

[10]吳紫筠，王興斌.5%咪喹莫特乳膏聯合阿達帕林凝膠治療跖疣的療效觀察[J].海峽藥學，2017，29（6）：144-145.

[11]鄭穎娜，張守民.脾氨肽聯合干擾素α-2b及阿達帕林凝膠治療泛發性扁平疣療效觀察[J].醫藥論壇雜志，2017， 38（4）：43-45.

[12]梁棟龍，余南生，謝禮豪，等.匹多莫德聯合伐昔洛韋及阿達帕林治療扁平疣的臨床療效[J].中國藥物經濟學，2017，12（10）：40-42.

[13]劉琴，肖桂鳳.微晶磨削聯合阿達帕林凝膠治療毛周角化癥療效觀察[J].公共衛生與預防醫學，2015，26（4）：110-111.

[14]歐洲藥典標準品（EDQM）[Z].2009.

[15]張春泓.阿達帕林凝膠劑的制備及質量控制方法研究[D].沈陽：沈陽藥科大學，2009.

[16]金建平，楊菁.HPLC測定阿達帕林的含量及其有關物質[J].中國藥學雜志，2005，40（10）：796.

[17]張春泓，趙迎春，韓春暉，等.高效液相色譜法同時測定阿達帕林凝膠劑中的主藥阿達帕林和兩種防腐劑[J].色譜，2008，26（5）：640-642.

[18]劉永洪，熊英.中西醫聯合光療綜合治療中重度痤瘡的臨床觀察[J].皮膚病與性病，2015，37（2）：98-100.

[19]王雪明，陸維艾，曾修超.痤瘡凝膠的研制及質量控制[J].中國醫院藥學雜志，2002，22（4）：210-212.

[20]夏愛曉，孫淵，孟賢.新型藥物凝膠劑研究進展[J].藥學實踐雜志，2015，33（3）：205-208，216.