冬蟲夏草對VDR沉默大鼠卵巢顆粒細胞CYP19表達的影響

貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002

卵巢作為女性的生殖腺，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)-下丘腦-垂體軸的調(diào)控之下，完成排卵和內(nèi)分泌的功能[1]。女性進入圍絕經(jīng)期以后，卵泡數(shù)量逐漸減少，引起骨質(zhì)疏松、抑郁、心血管疾病等，嚴重影響婦女的身心健康和生活質(zhì)量[2]。目前西醫(yī)治療主要采用激素替代療法，長期應(yīng)用不良反應(yīng)較為突出。中醫(yī)藥補腎益精療法有其獨特優(yōu)勢，其機制有待進一步闡明。近年對Vitamin D Receptor(VDR) 和1a-羥化酶基因沉默動物不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，維生素D對生殖功能的影響發(fā)揮作用。VDRmRNA表達已被證實是在卵巢[3]，在混合卵巢細胞及凈化的卵巢顆粒細胞培養(yǎng)物中對性激素類固醇生成起重要作用[3]。芳香化酶在雌激素合成過程中具有重要作用，無論雄性或雌性小鼠，VDR敲除后性腺芳香化酶(P450arom)活性低下，CYP19表達明顯降低。

維生素D能直接調(diào)節(jié)CYP19基因表達，從而調(diào)控雌激素分泌[4]。維生素D通過25-羥基維生素D 1-羥化酶(CYP27B1)在肝臟和腎臟中的活性形式(1,25-二羥維生素D)進行修飾，激活的維生素D通過維生素D受體(VDR)產(chǎn)生作用，這個系統(tǒng)在國外稱作維生素D軸[5]( Vitamin D system)，我國稱其為維生素D軸(Vitamin D axis)[6-13]。腎精虧損將導致生殖功能發(fā)生障礙。筆者中藥能使大鼠卵巢重量明顯增長。補腎法治療可以提高體內(nèi)雌激素水平,增強各激素靶器官的反應(yīng)性[14]。

冬蟲夏草是一種含有氨基酸、甘露醇、核苷、多糖、甾醇等多種活性成分的名貴中藥材，具有補腎填精、納氣平喘的功效。冬蟲夏草具有調(diào)節(jié)雌激素分泌作用[15]，腎精虧損將導致生殖功能發(fā)生障礙。筆者基于前期文獻及動物實驗研究，探討冬蟲夏草對VDR沉默卵巢顆粒細胞CYP19mRNA表達的影響，揭示其對卵巢功能的保護作用并提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雌性36只，大鼠購買于重慶解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，體重約150～180 g。許可證號：SCXK-(軍)20120011。

1.2 試劑及儀器 主要儀器：實時熒光定量PCR儀(Eppendorf，德國)，電泳儀(Bio-rad，美國)，凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀(Tianneng，美國)，GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)(UVP，美國)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)，電熱壓力蒸汽消毒器(浙江紹興醫(yī)療器械總廠)，高速臺式離心機(BACKMAN CS-15R，美國Beckman公司)。主要試劑:超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、2×EsTaqMasterMix(含染料)(北京康為世紀生物科技有限公司)。

表1 基因序列

1.3 方法

1.3.1 顆粒細胞培養(yǎng) 3～4周健康雌性SD大鼠，麻醉后取雙側(cè)卵巢，在解剖顯微鏡下剝離周圍脂肪組織，PBS沖洗后剪碎，用0.2%膠原酶及與0.25%胰蛋白酶消化25～30 min，加入DMEM/F12終止消化，以1000 r /min轉(zhuǎn)速離心5min后去除上清液，過篩后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37℃+5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)的顆粒細胞(GC)密度適中進行傳代。

1.3.2 大鼠卵巢顆粒細胞藥物模型構(gòu)建 將正常卵巢顆粒細胞及轉(zhuǎn)染后的細胞分別接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁后進行相應(yīng)處理。對照組、基因沉默陰性對照組、VDR沉默組按照常規(guī)培養(yǎng)的方式加入含15%血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)基[16]。已烯雌酚組、維生素D組、蟲草素處理組分別于正常大鼠卵巢顆粒細胞中加入含已烯雌酚、維生素D、高劑量蟲草素的含藥血清的培養(yǎng)基，干預處理24 h后進行后續(xù)實驗。VDR沉默+已烯雌酚組、VDR沉默+維生素D組、VDR沉默+蟲草素處理組分別于VDR沉默轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細胞加入含已烯雌酚、維生素D、高劑量蟲草素的含藥血清的培養(yǎng)基，干預處理24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3.3 實驗分組 1：對照組；2：基因沉默陰性對照組；3：VDR沉默組；4：VDR沉默+已烯雌酚組；5：VDR沉默+維生素D組；6：VDR沉默+蟲草含藥血清處理組。采用熒光定量PCR檢測法檢測VDR沉默大鼠卵巢顆粒細胞CYP19 mRNA表達。

2 結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，與對照組、基因沉默陰性對照組相比，VDR沉默組CYP19mRNA表達明顯下調(diào)(P<0.05)，VDR沉默+己烯雌酚組、VDR沉默+VD組、VDR沉默+冬蟲夏草含藥血清組與VDR沉默組比較，CYP19mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

對照組基因沉默陰性對照組VDR沉默組VDR沉默+已烯雌酚組VDR沉默+維生素D組VDR沉默+蟲草含藥血清處理組11.07±0.290.38±0.17*0.7±0.19#0.66±0.18#0.74±0.24#

注：與對照組、基因沉默陰性對照組比較，*P<0.05；與VDR沉默組比較，#P<0.05。

3 討論

中醫(yī)認為腎藏精主生殖，生殖功能是通過腎中先天之精激發(fā)而產(chǎn)生的，卵巢功能低下就其本質(zhì)而言即為腎精不足，故而臨床對于卵巢功能低下的治療多從補腎填精入手。由于中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學研究對象的同一性，現(xiàn)代醫(yī)學研究證明維生素D缺乏影響卵巢的組織形態(tài)及性腺分泌功能，實驗表明維生素D在調(diào)節(jié)卵巢活動中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不僅僅是維生素，還是一種激素，稱之為維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)[17]。該系統(tǒng)包括維生素D、代謝相關(guān)的酶以及維生素D作用的受體(VDR)[18]。除了鈣磷代謝外，維生素D在調(diào)控細胞有絲分裂，抑制多種組織細胞增殖、分化等方面都發(fā)揮較大作用。維生素D還有調(diào)節(jié)免疫、糖代謝、調(diào)控腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAS)等多種生物學作用，作用廣泛，在多個系統(tǒng)中發(fā)揮重大作用[8-9]。在下丘腦垂體軸的調(diào)控下，卵巢完成排卵和分泌性激素的功能。女性進入圍絕經(jīng)期以后，卵泡數(shù)量逐漸減少，可能誘發(fā)心血管疾病以及骨質(zhì)疏松，嚴重影響婦女的身心健康和生活質(zhì)量。目前西醫(yī)治療主要采用激素替代療法，長期應(yīng)用有很多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥補腎填精療法有其獨特優(yōu)勢，其療效在臨床已經(jīng)逐步得到驗證，而其機制有待進一步闡釋。近年對VDR和1a-羥化酶基因沉默動物不斷深入研究，可以發(fā)現(xiàn)維生素D對生殖功能的影響發(fā)揮作用。VDRmRNA表達已被證實是在卵巢，在混合卵巢細胞及凈化的卵巢顆粒細胞培養(yǎng)物中對性激素類固醇生成起作重要作用。本研究采用熒光定量PCR檢測法檢測冬蟲夏草對VDR沉默大鼠卵巢顆粒細胞中CYP19mRNA表達的影響，實驗結(jié)果顯示，與對照組、基因沉默陰性對照組相比，VDR沉默組CYP19mRNA表達明顯下調(diào)(P<0.05)，VDR沉默+己烯雌酚組、VDR沉默+VD組、VDR沉默+冬蟲夏草含藥血清組與VDR沉默組比較，CYP19mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.05)。從試驗結(jié)果可以看出，冬蟲夏草具有一定的調(diào)節(jié)維生素D軸的功能。

4 結(jié)論

綜上所述，冬蟲夏草對卵巢顆粒細胞的保護與促進作用與維生素D、己烯雌酚相似，動物實驗結(jié)果證實冬蟲夏草對卵巢功能的保護作用通過維生素D軸發(fā)揮效應(yīng)，冬蟲夏草可以通過調(diào)節(jié)CYP19產(chǎn)生類維生素D樣作用,對大鼠的卵巢顆粒細胞分泌功能產(chǎn)生影響，同時通過調(diào)節(jié)維生素D軸對大鼠的卵巢產(chǎn)生保護作用。但導致卵巢功能低下的因素眾多，冬蟲夏草是否還可以通過其他機制來改善卵巢功能，還有待更進一步的研究。

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