HPLC法檢測蔬菜水果中赤霉素的殘留量

□ 趙 燕 浙江鼎龍科技有限公司 錢輝俊 杭州海泰檢測有限公司檢測中心 陳 偉 浙江鼎龍科技有限公司

1 材料與辦法

1.1 材料準備

本次實驗中使用的設備包含高效液相色譜檢測儀器、波長紫外檢測儀器、高速勻漿機、旋轉蒸發儀等；使用的溶劑包含甲醇標準品、冰乙酸標準品、乙酸乙酯標準品、石油醚標準品、鹽酸溶液標準品和赤霉素標準品。

1.2 檢測辦法

1.2.1 對標準儲備液進行配制

稱取含量大于99.0%的赤霉素0.123 1 g，使用甲醇將其溶解同時定容到100 mL。這時該溶液的濃度為每毫升中含有1.00 mg赤霉素。

1.2.2 選取樣品處理辦法

①對溶劑進行提取。提取劑選用了甲醇與丙酮溶液，將2.0 mg/kg赤霉素標準溶液加入其中檢測回收率。②選擇提取方式。實驗的樣品選定為油麥菜，同時采用高速勻漿提取方式提取2 min，使用超聲波振蕩方式處理15 min，使用超聲波振蕩方式振蕩30 min，之后對效率進行對比。③凈化條件的選擇。選擇的實驗樣品為西紅柿與油麥菜，將5.0 mg/kg的赤霉素標準溶液加入樣品中，之后采用凈化處理，然后比較回收率。

1.2.3 驗證檢測辦法線性關系、檢出限、精密度等

稀釋赤霉素標準溶液，之后使用儀器對其進行檢測，設置y表示峰面積，x表示質量的濃度，之后繪制回歸標準曲線。在操作人員一致、實驗地點一致、處理方法一致的前提下，在短時間內測量其中的赤霉素含量。之后選取三個不同的實驗地點，同時加入5.0 mg/kg赤霉素標準溶液，反復測試白菜樣品。然后將不同濃度的赤霉素標準溶液添加到番茄、白菜、辣椒、香蕉、葡萄、油麥菜中，之后測試其回收率，再對空白樣品與加標樣品回收率進行比較，同時重復3次實驗。

圖1 赤霉素溶液的高效液相色譜圖

2 結果與分析

2.1 確定提取條件

2.1.1 溶劑的提取

將甲醇作為主要提取劑可以獲得85.3%～92.1%的回收率，將丙酮作為提取劑時可以獲得82.7%～107.3%的回收率。兩種提取劑的回收率較為類似，但相比于丙酮來說，甲醇價格低廉，同時還不會含有較高的毒性，因此在本次實驗中赤霉素的提取溶劑采用了甲醇。

2.1.2 提取方式

使用高速勻漿與超聲波振蕩的提取方式，振蕩處理30 min后回收率分別會達到標準，符合實驗要求。但使用超聲波振蕩處理方式會需要更多的時間，同時對提取瓶密封性提出較高要求，從而降低實驗效率，因此本次實驗中采用了高速勻漿的提取方式。

2.2 選擇凈化條件

融合C18柱固相萃取凈化方法與液液萃取方法，可以使回收率達到71.6%～89.5%，但使用液液萃取與反萃取互相結合的方式可以獲得84.5%～96.1%的回收率。可以看出，將液液萃取與反萃取凈化方式結合使用的方式，可以使凈化效果更佳，同時也不會對目標峰附近產生較多干擾，因此本次實驗選取了液液萃取與反萃取凈化互相結合的凈化方法。為了盡可能降低實驗干擾，實施凈化處理之前，實驗人員采用石油醚徹底清除實驗樣品中的色素。

2.3 選取色譜條件

2.3.1 對波長進行檢測

在200～400 nm波長范圍前提下，赤霉素的紫外吸收性最高，這時利用紫外線掃描赤霉素，可以獲取赤霉素的波長值，同時206 nm情況下會具備最強的吸收性，因此本文實驗采用的波長值為206 nm，同時使用該波長對赤霉素進行檢測。

2.3.2 色譜柱分析

赤霉素作為二萜類酸的一種，其分子特點為中等極性，因此對固定相進行選擇適應，選擇較小極性的鍵合固定相，因此在本文實驗的色譜分析方式為C18柱[1]。

2.3.3 流動相分析

由于赤霉素自身性質因素的影響，因此檢測過程應在溫度較低的酸性條件下。在pH值達到3～4，赤霉素溶液處于最穩定狀態。因此，在本次實驗中，將0.1濃度冰乙酸水溶液與甲醇共同作為流動相。通過實驗與結果可以看出，使用45%濃度時會獲得最佳的峰型，出峰時間更加合理，還可以加強雜質的分離效果。因此實驗中流動相使用了0.1%濃度的冰乙酸水溶液與甲醇，流動相的配比情況為45+55。

2.4 液相色譜分析

通過制作赤霉素標準溶液與油麥菜加標樣品的液相色譜圖，使用上文中描述的方式分析樣品，可以確保蔬菜樣品雜質峰、目標峰保持分離，從而充分滿足赤霉素的定量、定性需求。

2.5 對線性關系、檢出限準確性進行檢測

赤霉素的線性關系公式為：y=4E-05x+0.2785，相關系數為：r2=0.9999，從公式中可以看出線性關系較好。由于赤霉素的最低檢出濃度為0.067 mg/kg，通過對油麥菜中赤霉素含量平行性測定結果可以看出，本文采用的方法與標準偏差值不超過10%。本文使用的方法RSD值都不超過10%，可以確保重復性滿足實際應用需求。本文采用的蔬菜水果樣品包含油麥菜、番茄、白菜、辣椒、香蕉、葡萄，通過對樣品加標回收率及相對標準偏差進行實驗與計算后可以看出，回收率都處于71.6%～105.2%，RSD值均為2.1%～9.8%，變異系數均不超過10%，可以說明在進行檢測與分析時，并沒有出現顯著的誤差，也可以證明赤霉素樣品分析結果十分準確[2]。

2.6 測定方法的成立

2.6.1 樣品的預處理

在250 mL三角瓶中加入20 g試樣，之后將60 mL 80%的甲醇溶液加入其中，勻漿提取時間為2 min，之后使用布氏漏斗進行抽濾，將提取出的溶液加入到250 mL分液漏斗中，之后使用20 mL甲醇溶液對其進行2次重復潤洗濾渣，并將提取液合并。之后將20 mL石油醚加入到提取液中，使用混勻與靜止處理方法對其進行處理后，可以使石油醚層被有效去除。然后將完成脫色的提取液放置在40 ℃條件下進行減壓濃縮處理，直至容量為20 mL，在其中加入鹽酸溶液對pH值進行調節，pH值達到2.5～2.8后，將20 mL乙酸乙酯加入其中并進行3次的反復萃取，使乙酸乙酯相合并，再次進行減壓濃縮至20 mL。再使用相同容量的磷酸鹽緩沖溶液進行3次反萃取，之后對磷酸鹽緩沖液進行合并，將pH值使用鹽酸溶液調節至2.5～2.8，并加入20 mL乙酸乙酯進行3次萃取，最后在40 ℃條件下完成減壓蒸干處理。處理后加入2 mL甲醇使殘渣溶解，使用0.22 μm有機濾膜進行過濾，然后裝入瓶中為液相色譜分析做準備。

2.6.2 色譜條件分析

完成液相色譜分析后，獲得以下結果：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C184.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm。流動相為：甲醇結合0.1%濃度冰乙酸水溶液（45+55）；流速為1.00 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長為206 nm。

3 結語

本文中的實驗采用了HPLC法對蔬菜水果中赤霉素含量進行檢測，通過實驗結果可以看出，實驗方法具備較強的檢測準確性、靈敏性，同時操作較為簡便，并不會對儀器設備提出過高要求。因此檢測人員可使用此種方法對蔬菜水果中赤霉素殘留量進行檢測。