木犀草素-乳清蛋白復合物對乳液物理穩定性和氧化穩定性的影響

袁婷蘭，朱雯婷，陳先鑫，劉文強，朱雪梅*，熊 華

穩定的水包油乳液是一種熱力學不穩定體系，由于乳液具有較大的界面面積，容易發生氧化，同時容易發生絮凝、聚集、分層等物理失穩現象，嚴重地影響了食品品質和安全；因此多采用往乳液中添加抗氧化劑的方法來增強乳液的穩定性[1]。人工合成的抗氧化劑由于食品安全問題逐漸被限制使用，而具有安全性和較強功能特性的天然抗氧化劑越來越廣泛地應用于食品乳液體系中[2]。

有研究發現黃酮類物質在乳液中除其本身表現的抗氧化能力之外，還能與蛋白質發生相互作用增強乳液的抗氧化性[3-4]。木犀草素是一種天然黃酮，屬弱酸性四羥基黃酮類化合物，在植物界分布較廣，具有抗氧化、消炎、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性[5-6]。然而木犀草素由于含有酚羥基等基團，脂溶性較差、微溶于水，在乳液體系中的物理分布存在很大的不確定性，極大地限制了其在食品乳液中的應用[7]。木犀草素所具有的多羥基結構不僅決定了該物質具有強的抗氧化特點，而且能與其他大分子物質的特征官能團發生相互作用而生成新物質。乳清蛋白在食品乳液中常作為乳化劑[8]，因其較高的營養價值、安全性及良好的表面活性可成為木犀草素理想的載體。當木犀草素與蛋白質分子鍵合[9]，形成乳清蛋白-木犀草素復合物，可有效提高其水溶性、穩定性和生物利用率。由于蛋白質具有較強的表面活性，能夠定向吸附到乳液的界面，當形成乳清蛋白-木犀草素復合物后，木犀草素也可能定向聚集在乳液的界面，有效抑制乳液氧化。

此外，在食品加工過程中的熱處理可能會導致蛋白質變性，可能會影響蛋白質和木犀草素的相互作用，導致吸附效率的提高和聚集體的形成。因此，本實驗探究天然乳清蛋白和熱處理后的乳清蛋白乳液在加入不同質量濃度木犀草素后，對于乳液物理穩定性和氧化穩定性的實際影響和作用規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油為市售；乳清分離蛋白（蛋白質量分數91%～92%） 愛爾蘭Glanbia公司；木犀草素 美國Sigma公司；其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BS 224S型電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；GYB 30-6S高壓均質機 上海東華高壓均質機廠；Zetasizer Nano ZS90激光納米粒度儀 英國馬爾文公司；JB-3型磁力攪拌器、PHS-3精密pH計 上海雷磁新徑儀器有限公司；T6紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；Ultra Turrax T25高速分散機德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 木犀草素和乳清蛋白相互作用的表征

配制乳清蛋白母液和熱處理乳清蛋白母液，濃度為3×10-5mol/L，其中一組乳清蛋白分散液在95 ℃水浴條件下加熱35 min，隨后迅速置于室溫下冷卻，得到熱處理乳清蛋白溶液；配制木犀草素母液濃度為7.2×10-4mol/L。

蛋白質內源光譜的測定[10]：將乳清蛋白母液的濃度稀釋為3×10-7mol/L，準確移取3.0 mL該稀釋溶液于石英熒光池中，用可調式移液器逐次加入一定體積木犀草素溶液（藥物的累加體積不超過0.096 mL），木犀草素濃度的變化范圍為0.0～8.4×10-6mol/L，混合均勻并靜置8 min。固定激發波長為280 nm，熒光發射光譜掃描范圍為300～500 nm，熒光激發狹縫為5 nm，發射狹縫為5 nm，在熒光光度計上記錄熒光發射光譜。根據Stern-Volmer方程（式（1））[11]得出Kq。

式中：F0為不添加木犀草素時的熒光強度；F為添加木犀草素后的熒光強度；Kq為分子猝滅過程速率常數/（L/（mol·s））；τ0為未添加木犀草素時的熒光壽命（10-8s）；c為添加木犀草素濃度/（mol/L）。

1.3.2 乳液的制備

用10 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液溶解乳清蛋白，制備兩組質量分數為1%的分散液，然后于室溫下磁力攪拌5 h，溶解充分后在4 ℃的環境下水化12 h，使乳清蛋白充分溶解。

第2天將分散液從冰箱取出。一組不作處理；另外一組待其恢復到室溫后，95 ℃水浴加熱35 min，隨后迅速置于室溫下冷卻。然后向兩組分散液中加入不同質量濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL）的木犀草素，并在室溫下攪拌6 h，使其充分反應，以形成蛋白質-木犀草素復合物，然后分別向上述2 組含有蛋白質-木犀草素復合物的溶液中加入體積分數10%玉米油，12 000 r/min高速分散機分散100 s，再經40 MPa高壓均質90 s。制備好的乳液用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液調pH值至7.0，待用。

1.3.3 乳液平均粒度和Zeta電位的測定

用磷酸緩沖溶液將新制備的乳液稀釋100 倍，采用Zetasizer Nano ZS90激光納米粒度儀測定各組乳液粒度和Zeta電位。

1.3.4 乳液穩定性的測定

穩定性測定參考盧錦麗[12]的方法，室溫條件下將上述乳液經蒸餾水稀釋1 000 倍后，通過紫外-可見分光光度計測得乳液在400、800 nm波長處的吸光度，用吸光比（specific absorptivity，SRI）A800nm/A400nm表征乳液的穩定性，當SRI＜0.3時乳液較為穩定。

1.3.5 乳液界面蛋白質量濃度和木犀草素質量濃度的測定

乳液界面吸附蛋白質量濃度的測定根據Shao Yun等[13]的方法并稍作改動。將1 mL乳液在25 ℃、15 000 r/min離心50 min，然后用注射器轉移離心后乳液的水層，并通過0.22 μm的水系微孔濾膜。濾液蛋白質量濃度采用Lowry法測定。將用于乳液制備的初始蛋白質分散液在同樣條件下離心，同理測定蛋白質量濃度。

另取1 mL乳液于小離心管，25 ℃、15 000 r/min離心50 min，過膜，采用紫外-可見分光光度計測濾液在349 nm波長處的吸光度[14]，木犀草素質量濃度由木犀草素標準曲線（y＝12.696x+0.455 8，R2＝0.998 2）計算。

1.3.6 乳液的熱耐受性和貯存穩定性

熱耐受性：將一定量放置于密閉玻璃試管中的乳液分別在55 ℃和95 ℃水浴中加熱35 min，冷卻至室溫。未經熱處理乳液為空白對照組。定期測量其粒徑，觀察其穩定性。

貯存穩定性：將乳液置于45 ℃的烘箱16 周，定期測量其粒徑，觀察其長期貯存穩定性。

1.3.7 乳液氫過氧化物的測定

將樣品置于45 ℃烘箱中加速氧化，并于1、3、6、11、13、15、19、22 d拿出分裝小樣進行氧化實驗的測定。過氧化值采用硫氰化鐵法測定，參考Kargar等[15]的方法。以不添加乳液的一組為對照。

1.3.8 次級氧化產物——丙二醛含量的測定

丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法，由Zhao Qiang等[16]的方法稍作改動。將1 mL去離子水、2 mL硫代巴比妥酸試劑混合于15 mL試管中，漩渦30 s后沸水浴加熱25 min，冷卻至室溫，然后2 500 r/min離心20 min，0.22 μm水系微孔濾膜過濾，測定上清液在532 nm波長處的吸光度。樣品中TBARS值可以通過1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準曲線計算。

1.4 數據統計分析

所有樣品重復測定3 次，取平均值，采用Origin 8.0和SPSS 16.0軟件處理數據，樣品平均值之間的差異性通過Duncan法比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 木犀草素和乳清蛋白的相互作用

由于生物大分子具有熒光發色團，實驗通過內源熒光光譜檢測基于微環境的極性變化而導致的熒光發色團結構變化來分析乳清蛋白的結構構象變化[17]。對加入不同濃度木犀草素的乳清蛋白乳液進行掃描，得到的熒光光譜圖見圖1。

圖1 乳清蛋白的熒光發射光譜Fig. 1 Fluorescence emission spectra of whey protein

由圖1可知，隨著木犀草素濃度的不斷增加，乳清蛋白在340 nm波長左右的熒光發射峰強度逐漸降低，說明木犀草素分子的存在降低了芳香氨基酸殘基間的能量傳遞，其與芳香族氨基酸的相互作用導致乳清蛋白熒光強度的猝滅。且添加木犀草素后，乳清蛋白的熒光發射峰從340 nm藍移到334.6 nm，熱處理乳清蛋白的發射峰從345 nm藍移到340.2 nm，表明木犀草素與蛋白質發生了相互作用[9]。張志恒等[9]研究結果發現血清白蛋白分子（human serum albumin，HSA）的熒光強度也隨木犀草素濃度增加而不斷降低，而且HSA的熒光發射峰的峰位出現了藍移，說明木犀草素與HSA發生了相互作用。此外，對比乳清蛋白和熱處理乳清蛋白的熒光發射峰，可以看出，熱處理后乳清蛋白的發射峰從340 nm紅移到345 nm，表明加熱使其所處環境的疏水性降低，氨基酸殘基更多暴露于極性微環境中，蛋白質的結構伸展程度可能有所增加[10]。

乳清蛋白和熱處理乳清蛋白的Kq值分別為4.83×1012L/（mol·s）和7.4×1012L/（mol·s），遠大于最大擴散碰撞猝滅常數（一般認為為2×1010L/（mol·s）），也說明乳清蛋白與木犀草素發生了靜態猝滅，形成了復合物[18]。

2.2 乳液的Zeta電位分析

由圖2可知，所有乳液的液滴Zeta電位表現為負值，與其理論帶有的電荷類型相吻合，表明油-水界面上分子間的排斥力大于吸引力（主要是疏水性和范德華力）[19]。所有乳液的電位介于-40～-45 mV之間，表明乳液系統較穩定。此外，木犀草素的質量濃度對天然組乳液的電位沒有顯著影響，而加熱組乳液，木犀草素質量濃度為0.05 mg/mL的乳液電位的絕對值最低，質量濃度為0.40 mg/mL的乳液其電位絕對值高于其他乳液，此時由乳清蛋白與木犀草素復合物穩定的乳液中蛋白質分子間的排斥力加強。加熱使乳清蛋白結合木犀草素分子數量不同，表面所帶電荷量不同，可能由于加熱處理的蛋白柔性區域、構象不同，這樣通過靜電相互作用所結合分子的能力不同。

圖2 乳液的Zeta電位Fig. 2 Zeta potential of emulsions

2.3 乳液的SRI分析

圖3 乳液的SRIFig. 3 SRI of emulsions

由圖3可知，所有乳液的SRI值介于0.16～0.18之間，加熱組中加入不同質量濃度木犀草素的乳清蛋白乳液，其SRI值沒有顯著的變化。表明本實驗中乳液物理穩定較好，再次說明乳液可以在較長時間內保持穩定而不會出現乳液的絮凝、聚結、分層等失穩現象，與前述電位的結果吻合。

2.4 乳液界面蛋白質量濃度以及界面木犀草素質量濃度

蛋白質在O/W乳液結構中的物理位置和取向分布與乳液的穩定性有著密切的關系。蛋白質可以通過靜電效應和空間位阻效應使得乳液保持較長時間的穩定[13]。木犀草素作為一種抗氧化劑，在油-水界面上更為有效，其抑制油脂氧化的作用與氧化通路上的化合物之間的反應相關[16]。由圖4A可知，乳清蛋白熱處理后，其在不同質量濃度木犀草素乳液的界面吸附量都低于相應未經過熱處理蛋白質在乳液界面吸附量。木犀草素質量濃度為0.20、0.40 mg/mL的乳液界面蛋白質量濃度有顯著差異，表明加熱處理和木犀草素的質量濃度均會會影響乳清蛋白與木犀草素的復合。而由圖4B可知，對于天然組乳液，隨著木犀草素質量濃度增加，分別有12%、40%、30%、43%的木犀草素吸附在乳液界面；對于熱處理乳液，相對應的有18%、33%、42.5%、45.5%的木犀草素吸附在乳液界面，這說明蛋白質的熱處理可以提高木犀草素在乳液界面的吸附。蛋白質熱處理后，由于蛋白質的空間結構發生了改變，形成了疏松多孔的結構[1]，推測木犀草素更易與蛋白質的氨基酸殘基發生交聯并形成復合物，但是蛋白質在乳液的界面吸附并沒有發生明顯的改變，即蛋白質并沒有從乳液界面中替換出來。可以推測本研究中蛋白質與木犀草素形成復合物后，二者產生協同作用，使得蛋白質和木犀草素都能吸附在乳液界面，而不發生排斥現象。蛋白質和小分子物質在乳液的界面吸附是一個多因素影響的復雜過程，其作用機理和方式還有待于進一步的研究探討。

圖4 乳液的界面蛋白質量濃度（A）和界面木犀草素質量濃度（B）Fig. 4 Interfacial protein content (A) and luteolin content (B) of emulsions

2.5 乳液的穩定性和熱耐受性

表1 45 ℃條件下乳液的粒徑變化Table 1 Evolution of the droplet size of emulsions druing storage at 45 ℃

乳液置于45 ℃環境下貯存16 周的粒徑變化趨勢見表1。貯存16 周后，乳液的粒徑都有不同程度的增加。對于天然乳液，木犀草素質量濃度為0.05 mg/mL的乳液粒徑增加至424.65 nm，其他乳液16 周后的粒徑都集中在360～380 nm。對于熱處理蛋白乳液，除了木犀草素質量濃度為0.40 mg/mL的乳液，其他蛋白乳液的粒徑集中于300～330 nm之間，說明木犀草素在高質量濃度時可能會引起乳液一定程度的聚集，導致乳液粒徑增加。對比貯藏16 周的天然乳液和熱處理蛋白乳液，可以看出，除了木犀草素質量濃度為0.40 mg/mL的乳液，所有熱處理蛋白乳液的粒徑比相應天然組乳液的粒徑小。綜合前述界面蛋白和界面木犀草素的實驗結果，可能是由于蛋白質熱處理后空間結構發生改變[20]，雖然界面蛋白質量濃度有所降低，但是由于其乳化性得到增強，抵消了蛋白質量濃度減少的劣勢；此外，可能由于更多的木犀草素容易吸附在熱處理蛋白乳液的界面，可以增加界面膜的厚度、強度和空間位阻，因此乳液較穩定。

崔健等[21]研究結果表明乳清分離蛋白乳液有較高的熱穩定性。為了評價加入木犀草素的乳清蛋白乳液的熱耐受性，本實驗還測定了在室溫環境下、55 ℃和95 ℃貯存8 周后乳清蛋白穩定的乳液的粒徑變化趨勢（數據未列出）。所有新制乳液的粒徑基本相同，介于260～290 nm之間，無顯著性差異（P＞0.05），貯存8 周后，乳液粒徑基本保持不變，而且乳液平均粒徑及分布在55 ℃和95 ℃貯存8 周過程中沒有明顯變化，也說明乳清蛋白乳液具有較好的穩定性。

2.6 乳液的氧化穩定性

圖5 木犀草素對乳液的過氧化值的影響Fig. 5 Effect of luteolin on POV of emulsions

圖6 木犀草素對乳液的TBARS值的影響Fig. 6 Effect of luteolin on TBARS value of emulsions

由圖5、6可以看出，加入木犀草素后乳液的過氧化值和TBARS值明顯減小，結果表明木犀草素在該體系中具有抗氧化活性[23]。脂質氫過氧化物降解形成高活性自由基是脂質氧化的主要原因，脂質氫過氧化物的兩親性決定了其主要定位于油-水界面[24-25]，乳液中木犀草素較高的抗氧化效率，再次證明抗氧化劑木犀草素有效的集聚在氧化反應發生最頻繁的O/W界面。

如圖5A、B所示，兩組乳液過氧化值變化趨勢基本一致，未加入木犀草素時，乳液的過氧化值在貯藏期間呈顯著的上升趨勢，貯藏18 d后，天然組和加熱組乳液過氧化值分別達到了26.71 mmol/kg，21.69 mmol/kg。而含木犀草素的乳液過氧化值隨著時間的延長緩慢增加，貯藏的前3 d，乳液的過氧化值先不斷增加，然后隨著貯藏時間的延長其過氧化值緩慢減小，直至13 d后乳液的過氧化值有所增加。貯存18 d后，加入木犀草素質量濃度為0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL，天然組乳液過氧化值分別為5.59、2.47、1.04、3.28 mmol/kg，其加熱組過氧化值分別為4.15、3.39、3.89、4.26 mmol/kg。木犀草素作為從天然植物中提取出來的抗氧化劑，其化學結構含有多個酚羥基，具有很強的提供氫原子的能力[26]，而油脂氧化過程中的脂肪酸自由基能與這些氫原子結合，被轉化為更穩定的惰性化合物，中止了油脂的氧化鏈式反應，從而起到抑制脂質自動氧化的作用[27]。此外，對比天然組和加熱組，未加入木犀草素的乳液，其加熱組過氧化值明顯低于天然組的，而加入木犀草素的加熱組乳液也表現出過氧化值更低的趨勢，這說明乳清蛋白熱處理后，由于其間空間結構展開、巰基等的暴露[20,22]，使其抑制油脂初級氧化的能力有所提高，其吸附更高質量濃度的木犀草素有助于抑制氧化。

由圖6可知，乳液TBARS值的變化趨勢和過氧化值基本一致。未加入木犀草素的乳液TBARS值增長最快，乳液加入木犀草素后，乳液的TBARS值顯著降低，乳液的次級氧化得到明顯抑制，氧化穩定性增強[28-29]，說明木犀草素在乳液中具有抗氧化效能。此外，對比天然組和加熱組未加入木犀草素的乳液，可以看出加熱組的TBARS值顯著高于天然組的，與乳液的初級氧化結果不同。TBARS值反映丙二醛的含量，但是氫過氧化物分解后除生成丙二醛以外還有更多的羰基化合物[30]，這說明乳清蛋白熱處理后其自身抑制丙二醛生成的能力下降，但是熱變性的乳清蛋白-木犀草素復合物的TBARS值總體趨勢低于天然乳清蛋白-木犀草素組；因此猜測木犀草素的抗丙二醛生成的能力強，可以抵消熱變性對乳清蛋白的影響，需要后期進一步實驗證明熱變性的乳清蛋白、熱變性乳清蛋白-木犀草素復合物、天然乳清蛋白-木犀草素復合物的結構與其抗氧化活性之間的構效關系。

3 結 論

本實驗研究了天然蛋白和熱處理蛋白2 種乳清蛋白與木犀草素之間的相互作用形成不同的蛋白質-木犀草素基態復合物對于乳液的物理和化學穩定性的影響。結果表明：1）熒光光譜顯示木犀草素和乳清蛋白發生了靜態猝滅相互作用，生成了基態復合物。2）乳液的電Zeta位分析和SRI測定結果表明蛋白質熱處理和木犀草素質量濃度對于乳液的物理穩定性未產生明顯的影響。3）蛋白質熱處理后，其在乳液的界面吸附量都低于相應未經過熱處理蛋白質在乳液的界面吸附量，而木犀草素的質量濃度對界面蛋白質量濃度未產生明顯影響；木犀草素在乳液界面的吸附含量隨著木犀草素質量濃度的增加而提高，蛋白質的熱處理在一定程度上可以提高木犀草素在乳液界面的吸附。4）乳液氧化穩定性的測定結果表明，木犀草素的添加顯著提高乳清蛋白乳液的氧化穩定性。后期需要更多實驗證明熱變性與否對的乳清蛋白自身結構的影響、對乳清蛋白-木犀草素復合物結構的影響，解釋熱變性乳清蛋白-木犀草素復合物的結構與其抗氧化活性之間的構效關系。

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