草蓯蓉多糖對氧化應激所致血管內皮細胞凋亡的抑制作用

崔香丹，何 鑫，朱潔波，劉莉園，全吉淑,*，尹學哲,*

血管內皮細胞覆蓋于血管內壁表面的單層扁平或多角形的細胞，組成血管第1道屏障，可分泌血管活性物質，具有調節血流、參與物質交換、調節血壓、抑制血小板聚集及血栓形成等功能，其損傷是引起高血壓和動脈粥樣硬化等心腦血管疾病發病的關鍵因素[1-2]。血管內皮細胞損傷多與氧化應激有關，當血管內皮細胞處于氧化應激狀態時會誘導細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，導致細胞氧化損傷和功能障礙[1-2]。引起內皮細胞損傷的因素有多種，如過氧化氫、氧化低密度脂蛋白、末端晚期糖基化終末產物、血管緊張素Ⅱ、細菌脂多糖、腫瘤壞死因子-α等[1-2]。過氧化氫是目前應用最為廣泛的氧化應激損傷劑之一，易透過細胞膜，可誘導內皮炎癥和內皮細胞凋亡[1-4]。叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，tBHP）是近年來常用的穩定的氧化應激損傷劑，損傷機制基本與過氧化氫相同，但具有穩定、不易分解的優勢[1,5]。故本研究采用tBHP損傷血管內皮細胞制備其氧化應激損傷模型。

草蓯蓉（Boschniakia rossica Fedtsch. et Flerov.）為列當科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，具有延年益壽、滋補強身、補腎壯陽以及潤腸止血等功效[5-8]。近年來的研究表明，草蓯蓉具有抗氧化、抗炎、保肝及抗癌等作用[6-8]。草蓯蓉多糖（Boschniakia rossica polysaccharides，BRPS）是草蓯蓉的重要活性成分[9-12]，無毒且具有抗高脂血癥和免疫增強等功能[9-10]，提示其在抗動脈硬化方面的應用潛能。本課題組新近研究還發現，BRPS對氧化應激所致肝細胞氧化損傷及凋亡具有抑制作用[11-12]，鑒于其較強的抗氧化作用以及抗肝細胞氧化應激能力，推測BRPS可能對血管內皮細胞的氧化應激損傷也有保護作用。但目前為止，BRPS對血管內皮細胞損傷的保護作用尚不清楚。因此，本研究采用tBHP誘導血管內皮細胞氧化損傷模型，探討BRPS對血管內皮細胞氧化損傷以及凋亡的抑制作用，旨在為草蓯蓉的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC） 南京凱基生物技術有限公司；DMEM培養基 以色列Bioind公司；胎牛血清 美國Gemini公司；四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶、小鼠β-actin抗體、兔抗小鼠二抗、羊抗兔二抗美國Sigma-Aldrich公司；丙二醛（malondialdelyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測試盒 南京建成科技有限公司；Hoechst33342、ROS測試盒、JC-1線粒體跨膜電位（mitochondrial membrane potentials，ΔΨm）測試盒、原位末端標記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡測試盒、細胞漿蛋白提取試劑盒、細胞線粒體分離試劑盒 碧云天生物技術有限公司；兔Bcl-2抗體、兔Bax抗體、兔細胞色素c（cytochrome c，Cyt c）抗體、小鼠Bid抗體、兔Caspase-3抗體、兔Caspase-3抗體、兔Caspase-8抗體、兔Caspase-9抗體、兔Cyt c氧化酶IV（Cyt c oxidase IV，Cox4）抗體 美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設備

二氧化碳細胞培養箱 美國Shel Lab公司；高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；酶標儀 深圳雷杜公司；迷你垂直板電泳儀、迷你轉印槽 美國Bio-Rad公司；化學發光凝膠成像分析系統 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BRPS的提取及活性成分測定

BRPS采用常規醇沉法提取，用Sevag法除蛋白質[13]。用苯酚-硫酸法[14]測定其多糖質量分數為86.5%。

1.3.2 BRPS對HUVEC毒性的測定

細胞于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液中進行常規培養及傳代。取對數生長期細胞接種于96 孔板，使細胞密度為5×104個/mL。待細胞完全貼壁后，換入含BRPS的無血清培養液使其質量濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L。24 h后，MTT法測定570 nm波長處的OD值，并根據下式計算細胞存活率[5]。以細胞存活率大于等于90%為標準確定BRPS安全劑量[15]。

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201809020

中圖分類號：TS201.2；R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1002-6630（2018）09-0127-07

引文格式：崔香丹, 何鑫, 朱潔波, 等. 草蓯蓉多糖對氧化應激所致血管內皮細胞凋亡的抑制作用[J]. 食品科學, 2018, 39(9):127-133. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201809020. http://www.spkx.net.cn

CUI Xiangdan, HE Xin, ZHU Jiebo, et al. Inhibition of Boschniakia rossica polysaccharides on oxidative stress-induced apoptosis in vascular endothelial cells[J]. Food Science, 2018, 39(9): 127-133. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201809020. http://www.spkx.net.cn

1.3.3 BRPS對tBHP損傷HUVEC存活率的影響

取對數生長期細胞接種于96 孔板，貼壁后換入BRPS無血清培養液使BRPS質量濃度分別為100、50、25 mg/L，依次記為BRPS100組、BRPS50組和BRPS25組（BRPS高、中和低劑量組）。培養24 h后，損傷組和BRPS各劑量組加tBHP溶液使其質量濃度為200 μmol/L，損傷12 h，正常組細胞則換入正常培養液。用MTT法測定各組細胞存活率。

1.3.4 細胞ROS水平的檢測

采用二氯熒光素乙酰乙酸鹽（dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）法檢測[16]。取對數生長期細胞接種于6 孔板爬片內，細胞分組及處理同上。細胞固定后，換入DCFH-DA無血清培養液，避光孵育20 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察，并用Image J軟件進行自動熒光定量分析。ROS作用下生成的二氯熒光素（dichlorofluorescein，DCF）可產生強綠色熒光，根據其熒光強度可衡量細胞內ROS水平[16]。

1.3.5 細胞MDA、GSH水平和SOD活力的檢測

將細胞接種于6 孔板，細胞分組和損傷處理同上。收集并裂解細胞，離心取上清液。按照測試盒說明書操作步驟測定細胞MDA、GSH含量和SOD活力。

1.3.6 ΔΨm的檢測

細胞線粒體跨膜電位（mitochondrial membrane potentials，ΔΨm）采用JC-1染色法檢測[17]。細胞分組及處理、制作爬片和固定方法同上。細胞固定后，換入JC-1染色工作液，避光孵育20 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察。ΔΨm高時，JC-1可形成聚合物，產生紅色熒光；ΔΨm較低時，JC-1為單體，產生綠色熒光，可根據紅、綠色熒光比值衡量ΔΨm水平[17]。

1.3.7 Hoechst染色法檢測細胞凋亡

采用Hoechst33342染色法檢測[18]。分組及處理、制作爬片和固定方法同上。細胞固定后，換入Hoechst33342染色液，封片后在熒光顯微鏡下觀察。細胞發生凋亡時，因細胞膜通透性升高，Hoechst33342染色液進入細胞內與已受損的DNA結合發出強藍色熒光，而正常細胞則發出均勻彌散的弱熒光，可根據細胞形態特征及熒光強度可綜合評價細胞凋亡水平[18]。

1.3.8 TUNEL染色法檢測細胞凋亡

TUNEL染色技術被認為是檢測細胞凋亡的金標準[19]。分組及處理同上。制作爬片和固定細胞，換入TUNEL檢測液，避光孵育60 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察[19]，并用Image J軟件進行自動熒光定量分析。

1.3.9 Western blot法檢測細胞Bax、Bcl-2、Cyt c、tBid、Caspase蛋白的表達

將細胞接種于培養皿中，細胞分組和損傷處理同上。收集細胞，提取總蛋白、胞漿蛋白和線粒體蛋白。依次進行電泳、轉膜、一抗及二抗孵育，化學發光法顯色后進行灰度分析[20]。

1.4 數據統計分析

結果以 ±s表示。利用SPSS 20.0統計軟件，采用單因素方差分析和t檢驗進行數據分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 BRPS對HUVEC的毒性

圖1 BRPS對HUVEC的毒性Fig. 1 Cell toxicity of BRPS on HUVEC

研究表明，BRPS高質量濃度時具有一定的細胞毒性[11-12]。因此，首先用MTT法檢測單純BRPS對HUVEC存活率的影響，結果見圖1。BRPS質量濃度小于等于100 mg/L時，HUVEC存活率均大于90%，與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），不顯示細胞毒性。因此，本研究選取100、50、25 mg/L作為BRPS干預劑量進行后續研究。

2.2 BRPS對tBHP損傷HUVEC存活率的影響

圖2 BRPS對tBHP損傷HUVEC存活率的影響Fig. 2 Effect of BRPS on viability of HUVEC injured by tBHP

tBHP是氧化應激損傷劑，可誘發細胞內自由基生成，并引發細胞膜的脂質過氧化，導致細胞損傷和死亡[2,16]。由圖2可知，與正常組比較，tBHP損傷組HUVEC存活率顯著降低（P＜0.05），為（49.4±4.1）%；而BRPS高、中和低劑量組HUVEC存活率分別為（71.3±11.2）%、（60.8±7.3）%和（54.3±3.2）%，與損傷組比較升高44.3%、23.1%和9.9%，差異顯著（P＜0.05）。提示BRPS預處理能抑制tBHP所致HUVEC氧化應激損傷。

2.3 BRPS對tBHP損傷HUVEC ROS水平的影響

tBHP是氧化應激損傷劑，氧化應激所致ROS在細胞內過量蓄積是引發血管內皮細胞損傷的主要原因[2]。熒光探針DCFH-DA本身沒有熒光，但在細胞內可水解成DCFH，繼而被過量ROS氧化生成DCF并發出綠色熒光[16]。

圖3 BRPS對tBHP誘導的ROS生成的影響Fig. 3 Effect of BRPS on tBHP-induced ROS formation in HUVEC

如圖3所示，與正常組比較，損傷組細胞產生強綠色熒光，熒光強度增高44 倍，提示細胞內ROS水平升高；而BRPS高、中和低劑量組細胞則產生微弱綠色熒光，與損傷組比較熒光強度分別下降93.1%、82.2%和64.6%，差異顯著（P＜0.05）；且隨BRPS質量濃度的升高，熒光強度呈減弱趨勢；提示BRPS預處理降低細胞內ROS水平。

2.4 BRPS對HUVEC MDA、GSH、SOD水平的影響

氧化應激主要來源于細胞內自由基生成增多及抗氧化防御體系破壞；打破機體的氧化與抗氧化平衡，機體便會產生氧化應激損傷[20-21]。SOD等抗氧化酶及GSH等抗氧化劑可共同形成細胞內抗氧化防御體系，有效對抗細胞內氧化應激損傷[20-21]。

由表1可見，與正常組比較，損傷組內皮細胞SOD活力和GSH含量顯著降低（P＜0.05），MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組內皮細胞SOD活力與GSH含量顯著升高（P＜0.05），MDA水平顯著降低（P＜0.05），提示BRPS預處理可上調HUVEC抗氧化防御能力。

表1 BRPS對HUVEC SOD活力、GSH和MDA含量的影響（n＝ 6）Table 1 Effect of BRPS on SOD activity, and GSH and MDA contents of HUVEC (n= 6)

2.5 BRPS對HUVEC ΔΨm的影響

線粒體是氧化磷酸化進行的場所，也是ROS產生的主要場所[3,17]。當細胞內積累過量ROS時，線粒體膜結構受損，線粒體滲透性轉換通道繼而開放，導致ΔΨm下降[3,17]。而這種ΔΨm的下降被認為是細胞凋亡過程中最早發生的事件[22]。JC-1是檢測ΔΨm的熒光探針，ΔΨm較高時，在線粒體基質中形成聚合物，產生紅色熒光；ΔΨm較低時，不能形成聚合物而形成單體，產生綠色熒光[17]。

圖4 BRPS對HUVEC ΔΨm水平的影響Fig. 4 Effect of BRPS on ΔΨm of HUVEC

如圖4所示，與正常組比較，損傷組內皮細胞ΔΨm降低；與損傷組比較，BRPS組細胞ΔΨm增高，隨BRPS劑量的升高，紅色熒光呈增強趨勢；綠色熒光呈減弱趨勢；提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC ΔΨm的下降。

2.6 HUVEC Hoechst33342染色結果

氧化應激誘導的血管內皮細胞損傷以及繼發的細胞凋亡是心血管疾病發生的核心事件[23]。Hoechst33342是可穿透細胞膜的藍色熒光染料，可用于細胞凋亡的檢測。它使正常細胞發出較弱藍色熒光，而細胞發生凋亡時，細胞膜通透性發生改變，染色液大量進入細胞內，加上細胞DNA結構受損，結合增強，熒光強度變強[18]。

圖5 HUVEC Hoechst33342染色結果Fig. 5 Hoechst33342 staining of HUVEC

由圖5可見，正常組細胞藍色熒光弱，染色均勻彌散，細胞數量較多。損傷組細胞熒光強，細胞數量明顯減少，可見細胞核發生固縮、核內呈顆粒狀明亮藍色熒光，出現明顯凋亡特征。BRPS組細胞核內顆粒狀明亮藍色熒光呈逐漸減弱趨勢，大部分細胞藍色熒光均勻彌散，接近正常組細胞特征。

2.7 BRPS對HUVEC凋亡的影響

細胞凋亡具有特定的生物化學和形態學變化特征，常用的檢測方法有形態學檢測、DNA片段化、線粒體膜電位、TUNEL法等，而TUNEL染色技術被認為是檢測細胞凋亡的金標準[19]。

圖6 BRPS對tBHP誘導的HUVEC凋亡的影響Fig. 6 Effect of BRPS on tBHP-induced apoptosis in HUVEC

如圖6所示，正常組幾乎看不到凋亡細胞；損傷組部分細胞出現核固縮等早期凋亡特征，與正常組比較，凋亡細胞明顯增多；與損傷組比較，BRPS組凋亡細胞明顯減少，BRPS高、中和低劑量組熒光強度分別下降59.1%、46.9%和32.5%，差異顯著（P＜0.05）；且隨BRPS劑量的升高呈遞減趨勢。提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC凋亡。

2.8 BRPS對HUVEC Caspase活化的影響

細胞凋亡主要有線粒體凋亡途徑、死亡受體途徑以及內質網應激途徑，而Caspase活化是細胞凋亡的典型生物化學特征，前二者分別以Caspase9和Caspase8為該途徑的關鍵酶，激活下游的凋亡執行者Caspase3，完成凋亡通路的最后共同環節[24-25]。

圖7 BRPS對HUVEC Caspase活化片段表達的影響Fig. 7 Effect of BRPS on the expression of active caspase subunits in HUVEC

由圖7可見，與正常組比較，損傷組細胞Caspase活化片段Cleaved caspase3（Cleaved c3）、Cleaved caspase8（Cleaved c8）和Cleaved caspase9（Cleaved c9）表達顯著升高（P＜0.05），分別為正常組的2.8、2.1 倍和3.0 倍；與損傷組比較，BRPS組細胞Caspase活化片段Cleaved c3、Cleaved c8、Cleaved c9表達顯著降低（P＜0.05），其中BRPS高劑量組中各活化片段的表達分別下降70.6%、45.9%和47.2%，提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC Caspase的活化，從而抑制HUVEC凋亡。

2.9 BRPS對HUVEC胞漿Cyt c蛋白表達的影響

線粒體在細胞凋亡中處于核心地位[3]。線粒體膜通透性的改變以及ΔΨm的下降使Cyt c從線粒體釋放至胞漿中，激活Caspase9及其下游的Caspase-3，從而誘導Caspase依賴性的經典線粒體凋亡途徑[3,26]。

圖8 BRPS對HUVEC胞漿Cyt c水平的影響Fig. 8 Effect of BRPS on cytoplasmic Cyt c in HUVEC

如圖8所示，與正常組比較，損傷組HUVEC胞漿Cyt c蛋白水平顯著升高（P＜0.05），為正常組的5.4 倍；與損傷組比較，BRPS組HUVEC胞漿Cyt c蛋白水平顯著下降（P＜0.05），BRPS高、中和低劑量組中分別下降71.4%、69.4%和22.4%；提示BRPS減少tBHP所致HUVEC線粒體Cyt c的釋放，抑制Caspase依賴的HUVEC凋亡。

2.1 0 BRPS對HUVEC Bcl-2、Bax和Bid蛋白表達的影響

Bcl-2家族在細胞凋亡過程中起關鍵作用，按功能可分為抗凋亡和促凋亡蛋白，后者又分成多結構域蛋白和只有BH3結構蛋白，代表性成員分別有Bax和Bid等[18,27]。抗凋亡成員，如Bcl-2，可保護線粒體完整性，阻止Cyt c釋放以及隨后的Caspase9活化，因此，抗凋亡成員和促凋亡成員之間平衡決定著細胞存亡，與細胞凋亡關系密切[18,28]。Bid蛋白可介導死亡受體凋亡途徑，經Caspase8切割形成有活性的Bid截短片段（truncated Bid，tBid），轉移至線粒體上，促進Cyt c的釋放，從而導致Caspase9和Caspase3的激活[29]。

圖9 BRPS對HUVEC Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Fig. 9 Effect of BRPS on the expression of Bcl-2 and Bax proteins in HUVEC

圖10 BRPS對HUVEC線粒體tBid水平的影響Fig. 10 Effect of BRPS on mitochondrial tBid of HUVEC

如圖9、10所示，與正常組比較，損傷組細胞Bax蛋白表達上調1.5 倍，Bcl-2蛋白表達下調0.5 倍，Bax/Bcl-2比值升高2.8 倍，線粒體tBid水平升高1.1 倍，差異均顯著（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS高、中和低劑量組細胞Bax相對表達量分別降低57.1%、44.3%和19.0%，Bcl-2相對表達量分別升高136.4%、27.3%和9.1%，Bax/Bcl-2比值分別下降81.9%、56.3%和25.8%，線粒體tBid水平分別下降45.5%、44.5%和36.4%，差異顯著（P＜0.05），提示BRPS可通過阻止Bid活化以及降低Bax/Bcl-2比值而抑制HUVEC凋亡。

3 討 論

氧化應激是常見的應激損傷，主要表現為細胞內生成過量ROS，并造成細胞損傷和死亡。血管內皮細胞對氧化應激非常敏感，過量ROS可使內皮細胞膜脂質、蛋白質和核酸發生變性損傷，導致內皮細胞結構受損和功

能喪失[1]。tBHP是氧化應激誘導劑，以tBHP為損傷劑構建內皮細胞氧化應激損傷模型已非常普遍和成熟[30-32]。本實驗結果顯示，tBHP對HUVEC顯示細胞毒性，表現為細胞存活率降低，ROS生成水平升高，抗氧化防御能力下降，線粒體Cyt c的釋放增多，ΔΨm下降，細胞凋亡增多。提示tBHP引發HUVEC氧化應激損傷，導致HUVEC凋亡，這與前人報道相吻合[30-32]。本研究結果顯示，BRPS預處理能增高HUVEC存活率，降低細胞ROS水平，增強抗氧化防御能力，升高ΔΨm水平，抑制細胞凋亡，提示BRPS能改善tBHP誘導的HUVEC氧化應激損傷，抑制細胞凋亡。從分子水平發現，BRPS下調HUVEC線粒體Cyt c的釋放，下調線粒體tBid水平，降低Bax/Bcl-2比值，抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化。據文獻報道，Caspase-9的激活由線粒體凋亡途徑介導，而Caspase-8的激活和Bid的切割需要死亡受體的介導[26-29]。因此，BRPS對HUVEC凋亡的抑制作用可能與線粒體途徑和死亡受體途徑均有關。綜上所述，BRPS可清除HUVEC內自由基，減輕氧化應激損傷，抑制氧化應激所致HUVEC凋亡，對心血管疾病的防治起到積極作用。本研究為草蓯蓉的開發利用提供了科學依據。

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