岷江百合與蘭州百合鱗莖中多酚組分及其生物活性

靳 磊,張瑞軍,雅 蓉,張 萍

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

隨著人民生活水平的不斷提高,藥食同源、健康保健的食品逐漸受到人們的青睞。百合屬(Lilium)植物的鱗莖是典型的藥食同源食品,目前被人們廣泛接受和食用的是蘭州百合(L.davidiivar.unicolor)。然而,蘭州百合因其生長地域及產(chǎn)量逐漸受到限制,已無法滿足人們消費(fèi)日益增長的需求。因此,發(fā)掘野生百合資源,推出新型的適應(yīng)性強(qiáng)、藥用和保健價(jià)值高的可食用百合是非常必要的[1]。岷江百合(L.regale)是中國特有種,原產(chǎn)四川,為百合科(Liliaceae)百合屬多年生鱗莖類草本植物[2],因其對病毒、真菌及細(xì)菌具有極強(qiáng)的抗性,是百合育種中重要的種子資源[3]。現(xiàn)代研究表明,岷江百合鱗莖中富含多糖、生物堿、皂甙和多酚等多種生物活性物質(zhì),具有治療陰虛久咳、潤肺清熱的功效,因此在食品及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中具有重要的開發(fā)價(jià)值[1]。

多酚廣泛分布于植物的各個(gè)器官中,其天然提取物具有抗癌、預(yù)防心臟病、抗病原體、抑菌和延緩衰老等功效,由此應(yīng)用于醫(yī)藥、食品以及保健品中[4]。已有學(xué)者對白花百合(L.candidum)、卷丹(L.lancifolium)、山丹(L.pumilum)、渥丹(L.concolor)及宜昌百合(L.leucanthum)的鱗莖進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其鱗莖多酚提取物對多種自由基的清除、銅離子還原力、金屬螯合力及抑制脂質(zhì)過氧化等均具有良好的活性[5-7];也有研究者對宜昌百合、卷丹和蘭州百合鱗莖提取物的抑菌活性進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等細(xì)菌確有抑制作用[8-9],但對其有效成分并未進(jìn)行分析鑒定,因而亦無法判斷抑菌的具體功能成分。目前,對岷江百合的研究主要集中在遺傳多樣性[10]、組培快繁[11]、基因克隆[12]、病毒檢測[13]及生理特性[14]等方面,缺乏對其鱗莖多酚組分、含量及生物活性的綜合研究,這不利于岷江百合在食用和藥用方面的開發(fā)利用。

因此,本研究選取野生岷江百合為試材,研究其鱗莖中多酚組分、含量,及其抗氧化和抑菌活性,并與蘭州百合作比較,討論岷江百合作為藥用植物和功能性食品的開發(fā)前景,旨在為野生岷江百合資源綜合利用提供信息,為開發(fā)利用岷江百合這一寶貴的天然資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州百合 于2016年8月購自甘肅毅源有限公司;岷江百合 于2016年8月采自四川省茂縣(經(jīng)緯度:103°51′E,31°41′N,海拔:1670 m);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、產(chǎn)氣桿菌(Clostridiumperfringens)、變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris) 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院;水溶性維生素E、單體酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97%)、DPPH粉末、ABTS粉末 美國Sigma公司;色譜甲醇、新亞銅、菲洛嗪、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉 南京化學(xué)試劑股份有限公司;牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基(將3.0 g牛肉膏,10.0 g蛋白胨,5.0 g氯化鈉,15.0 g瓊脂溶于1000 mL蒸餾水中,將pH調(diào)至7.0) 實(shí)驗(yàn)室自制;液體培養(yǎng)基 除不加瓊脂外,其他組分與其固體培養(yǎng)基相同,實(shí)驗(yàn)室自制;其他常規(guī)試劑 均為分析純，天津博迪化工股份有限公司。

UV-4803型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;SENCO-R型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 申生(上海)生化儀器廠;5424型艾本德臺(tái)式高速離心機(jī) 南京貝登電子商務(wù)有限公司;XC-600C數(shù)控智能型超聲清洗器 濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司;LC-2010型島津液相色譜儀 蘇州創(chuàng)普儀器有限公司;HNY-211A型恒溫?fù)u床 杭州聚同電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 百合鱗莖中多酚的制備 將百合鱗莖去泥、洗凈,自然陰干,粉碎后過100目篩。稱取百合干粉25.00 g于三角瓶中,按照料液比1∶30 (m/v,g·mL-1)加入750 mL酸化甲醇溶液(甲醇∶1 mol·L-1鹽酸∶水,80∶1∶19,v/v/v),在60 Hz,30 ℃下提取20 min,之后于4 ℃低溫離心10 min(12000 r·min-1),收集上清液,連續(xù)提取2次,合并所有上清液于30 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取溶劑,濃縮后冷凍干燥成粉,備用[15]。所有步驟均在避光條件下進(jìn)行。

1.2.2 百合鱗莖多酚提取物中總多酚含量的測定 總多酚含量測定采用福林酚法[16],標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0976x+0.0014,R2=0.9993(x和y分別表示吸光值及濃度),結(jié)果以每千克鱗莖中含有沒食子酸的質(zhì)量(mg)表示;總黃酮含量采用亞硝酸鈉-氯化鋁顯色法[17]測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.1054x-0.002,R2=0.9930(x和y分別表示吸光值及濃度),結(jié)果以每千克鱗莖中含有蘆丁的質(zhì)量(mg)表示;總黃烷醇含量測定采用香草醛比色法[18],標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.6467x-0.0012,R2=0.9986(x和y分別表示吸光值及濃度),結(jié)果以每千克鱗莖中含有兒茶素的質(zhì)量(mg)表示。

1.2.3 百合鱗莖中單體酚含量的測定 稱取1.2.1中多酚提取物0.50 g,加入5 mL色譜甲醇溶解,經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后進(jìn)行分析檢測。色譜條件[7]:HibarRT Lichrospher反相C18柱(5 μm,250 mm×4.0 mm),柱溫:40 ℃;檢測波長分別為280、320、365 nm;進(jìn)樣量:1 mL;流速:0.5 mL·min-1;梯度洗脫的流動(dòng)相A為甲酸高純水(體積分?jǐn)?shù)0.1%),流動(dòng)相B為乙腈。洗脫程序:0～40 min,A:95%～60%,B:5%～40%;40～45 min,A:60%～0,B:40%～100%;45～60 min,B:100%。檢測完畢后與混合標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比對,所得結(jié)果用峰面積為縱坐標(biāo) Y,質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1)并計(jì)算各單體酚化合物的含量,結(jié)果以每千克鱗莖中各單體酚的質(zhì)量(mg)表示。

表1 14種單體酚的回歸方程

1.2.4 抗氧化活性的測定 稱取1.2.1中百合鱗莖多酚提取物0.10 g,用甲醇定容于50 mL容量瓶中,用于清除DPPH自由基活性、清除ABTS自由基活性、清除羥自由基活性、還原銅離子能力、抑制脂質(zhì)過氧化物活性及金屬離子螯合能力的測定。

1.2.4.1 清除DPPH自由基活性的測定 將百合鱗莖多酚復(fù)溶液(下簡稱樣品液)0.1 mL與3.9 mL濃度為25 μg·mL-1DPPH溶液混合,避光條件下反應(yīng)30 min,于517 nm處測定其吸光值,以甲醇為空白對照,結(jié)果以每千克百合鱗莖干粉中水溶性維生素E物質(zhì)的量(μmol·kg-1)表示[19]。

1.2.4.2 清除ABTS+自由基活性的測定 將樣品液0.1 mL與3.9 mL ABTS+反應(yīng)液混合,避光條件下反應(yīng)10 min后測定其吸光值,結(jié)果以每千克百合鱗莖干粉中水溶性維生素E物質(zhì)的量(μmol·kg-1)表示[20]。

1.2.4.3 還原銅離子的能力 取樣品液0.1 mL,依次加入CuSO4(5 mmol·L-1)、neocuproine(3.75 mmol·L-1)、NH4COOH緩沖液(1 mol·L-1,pH=7.0)和H2O各1 mL,避光條件下反應(yīng)30 min,于450 nm處測定其吸光值,結(jié)果以每千克百合鱗莖干粉中水溶性維生素E物質(zhì)的量(μmol·kg-1)表示[18]。

1.2.4.4 清除羥自由基活性的測定 取樣品液0.1 mL,加入FeSO4(9 mmol·L-1)、水楊酸-甲醇溶液(9 mmol·L-1)、H2O2(8.8 mmol·L-1)各1 mL。在37 ℃下反應(yīng)15 min后離心5 min(4000 r·min-1),于510 nm處測定其吸光值[21]。以甲醇為空白對照,結(jié)果以清除率(%)表示。

清除率(%)=(A0-AX)/A0×100

式中,AX為待測液吸光值;A0為對照液吸光值。

1.2.4.5 抑制脂質(zhì)過氧化物活性的測定 取樣品液50 μL,依次加入1%脂質(zhì)體2 mL,25 mmol·L-1FeCl30.1 mL、25 mmol·L-1H2O20.1 mL、25 mmol·L-1VC0.1 mL、pH=7.4的PBS 1.65 mL,37 ℃下反應(yīng)1 h,加入20 mg·mL-1BHT 1 mL終止反應(yīng)。隨后,加入1% TBA 1 mL和10% HCl 1 mL,沸水浴顯色反應(yīng)30 min,冷卻后加入CHCl33 mL,4000 r·min-1離心10 min,取上清液于532 nm處測定其吸光值[22]。以甲醇為空白對照,結(jié)果以抑制率(%)表示。

抑制率(%)=(A0-AX)/A0×100

式中,AX為待測液吸光值;A0為對照液吸光值。

1.2.4.6 金屬離子螯合能力 吸取百合鱗莖多酚樣品液1 mL,依次加入2 mmol·L-1FeCl20.05 mL、2.5 mmol·L-1Ferrozine溶液0.15 mL和H2O 3.8 mL,反應(yīng)10 min后于562 nm處測定其吸光值[23]。以甲醇為空白對照,結(jié)果以螯合率(%)表示。

螯合率(%)=(A0-AX)/A0×100

式中,AX為待測液吸光值;A0為對照液吸光值。

1.2.5 百合鱗莖多酚提取物抑菌活性的測定

1.2.5.1 抑菌活性的測定 采用比濁法測定百合鱗莖多酚提取物對4種細(xì)菌的抑菌活性[9]。將不同細(xì)菌菌種配制成菌懸液,控制各菌種濃度至OD600值約為1(OD600指波長600 nm處的吸光值)。稱取百合多酚提取物1.0 g,溶于200 mL甲醇中,制成5 mg/mL溶液,用0.22 μm過濾器過濾。取50 mL三角瓶,加入牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基(滅菌后)20 mL,加入菌懸液0.1 mL,樣品液0.5 mL,于37 ℃恒溫?fù)u床(160 r·min-1)培養(yǎng)8 h,設(shè)3個(gè)重復(fù),在600 nm處測定培養(yǎng)溶液的OD600值。同時(shí)以分別加入甲醇、樣品液或細(xì)菌菌懸液的培養(yǎng)溶液為對照,以牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基作空白調(diào)零。吸取上述各培養(yǎng)液0.1 mL,分別涂于牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上,37 ℃下倒置恒溫培養(yǎng)12 h,觀測其細(xì)菌菌落數(shù)。

1.2.5.2 最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)的測定 將百合鱗莖多酚提取物(凍干粉)用甲醇溶解,以相應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋成質(zhì)量濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.13、1.57 mg/mL的溶液,用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾。取樣品溶液0.3 mL,在各試管中加入菌液20 μL,置于37 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)12 h。分別取100 μL培養(yǎng)液均勻涂于牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上,37 ℃倒置恒溫培養(yǎng)12 h,取出后各梯度涂板,未見生長細(xì)菌的最小濃度為最低抑菌濃度(MIC)[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;數(shù)據(jù)作圖采用Excel 2007軟件,方差分析和均值比較利用SPSS 19.0軟件完成,采用LSD法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種百合鱗莖中總多酚、總黃酮和總黃烷醇含量分析

由表2知,兩種百合鱗莖中多酚類物質(zhì)含量存在顯著差異(p<0.05),岷江百合鱗莖中總多酚含量高達(dá)41773.87 mg·kg-1,是蘭州百合多酚含量的2.07倍;本研究中兩種百合鱗莖中總多酚的含量遠(yuǎn)高于百合科植物大蔥和洋蔥[25],而且多酚物質(zhì)可以修復(fù)自由基引起的生物大分子損傷從而起到良好的保健功效,因而百合作為抗氧化保健食品的應(yīng)用前景廣闊;黃酮是具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一類多酚化合物,具有預(yù)防癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退化性疾病及抗氧化等多種生物活性[9]。野生岷江百合鱗莖中總黃酮含量顯著高于蘭州百合(p<0.05),是其含量的2.25倍;黃烷醇是黃酮中一類重要的化合物,影響植物食用時(shí)的結(jié)構(gòu)感和苦味[26]。野生岷江百合鱗莖中黃烷醇含量是蘭州百合的3.16倍,說明野生岷江百合在食用時(shí)苦味感要強(qiáng)于傳統(tǒng)食用的蘭州百合。

表2 兩種百合鱗莖中總酚、總黃酮及總黃烷醇的含量(mg·kg-1)

2.2 兩種百合鱗莖中單體酚的含量分析

HPLC法已成為一種高效、可靠分析鑒定植物多酚類化合物的方法[27]。為進(jìn)一步探究百合鱗莖中多酚類物質(zhì)組分,本研究通過高效液相色譜法對兩種百合鱗莖中14種單體酚的含量進(jìn)行了定性和定量分析(見圖1),其中包括6種酚酸類物質(zhì)(沒食子酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸)、4種黃酮醇(金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷和廣寄生甙)、2種黃烷醇(兒茶素和表兒茶素)、1種查爾酮(根皮素)和1種原花青素(原矢車菊素 B2)。由表3可知,岷江百合鱗莖中兒茶素、蘆丁、異槲皮苷以及原矢車菊素B2含量相比其他檢測出單體酚的含量較高,而蘭州百合中原矢車菊素B2和沒食子酸含量相對較高;除沒食子酸外,岷江百合鱗莖中其他被檢測出的單體酚含量顯著高于蘭州百合,尤其綠原酸、丁香酸、咖啡酸和蘆丁的含量遠(yuǎn)高于蘭州百合,是其含量的16.98～41.84倍。Francis等[28]研究表明,在麝香百合(L.longiflorum)中也存在槲皮素、山奈酚等單體酚化合物,但并未對其定量檢測,因此缺乏數(shù)據(jù)與本研究對比;而表3中所測的14種單體酚物質(zhì)的總量遠(yuǎn)低于表2中的總多酚含量,這是由于百合鱗莖中除了已測的單體酚物質(zhì)外還含有其他單體酚類物質(zhì)未被檢出,這與朱怡霖等[29]的研究結(jié)果一致。

圖1 兩種百合鱗莖中單體酚HPLC色譜圖

表3 兩種百合鱗莖中單體酚的含量(mg·kg-1)

2.3 百合鱗莖多酚提取物的抗氧化分析

體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法較多,但不同評(píng)價(jià)體系,反應(yīng)原理和評(píng)價(jià)側(cè)重點(diǎn)都有所不同,評(píng)價(jià)結(jié)果往往也會(huì)存在較大差異,不能完全代表測試樣品其他抗氧化活性。因此,采用多種不同方法來評(píng)價(jià)測試樣品的抗氧化性更有說服力[30]。因此,本研究中選擇了DPPH、ABTS+、羥自由基清除力、銅離子還原力、金屬螯合力和抑制脂質(zhì)過氧化活性等6種不同反應(yīng)機(jī)理的方法對蘭州百合和岷江百合鱗莖多酚提取物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,兩種百合鱗莖多酚提取物對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基的清除,銅離子還原力、金屬螯合力及抑制脂質(zhì)過氧化等均具有一定的活性(表4)?；诓煌淼?類評(píng)價(jià)方法,雖然在抗氧化能力的數(shù)值上差異較大,但在評(píng)價(jià)兩種百合多酚提取物的抗氧化能力時(shí)卻具有相同的趨勢,即不同抗氧化評(píng)價(jià)方法中野生岷江百合的抗氧化活性均顯著高于蘭州百合(p<0.05),是蘭州百合的1.47～2.41倍。與常見的食用根莖類植物,如馬鈴薯和胡蘿卜[31]相比,岷江百合鱗莖多酚提取物對DPPH和ABTS+自由基清除能力顯著較強(qiáng)(p<0.05),加之百合鱗莖本就是我國傳統(tǒng)食用食品,本研究結(jié)果既促進(jìn)食用百合功能食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,又為我國野生百合屬資源的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

表4 兩種百合鱗莖多酚提取物的抗氧化能力

2.4 兩種百合鱗莖多酚提取物抑菌活性的比較

OD600值越大,表示培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量越多,其抑菌活性越弱。兩種百合鱗莖多酚提取物對4種細(xì)菌均有抑菌活性(圖2),并且岷江百合多酚提取物對4種細(xì)菌的抑菌活性均高于蘭州百合。由表5可知,岷江百合鱗莖多酚提取物對革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌,革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的抑制活性O(shè)D600值比蘭州百合分別低0.67、0.33、0.68、0.59，是蘭州百合抑菌活性1.40～14.40倍。比濁法是通過測定懸浮物質(zhì)的透光強(qiáng)度來估算其濃度的方法[32]。在抑菌研究的相關(guān)領(lǐng)域,已有學(xué)者采用此方法對活性物質(zhì)的抑菌活性進(jìn)行分析測定。Wei等[33]采用比濁法測定了合成殼聚糖基銀納米粒子對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性;蒲飛[32]也利用此方法測定了不同基因型柿果實(shí)甲醇提取物的抑菌能力。本研究結(jié)果表明,野生岷江百合多酚提取物對4種常見致病細(xì)菌均有抑制作用,且顯著強(qiáng)于蘭州百合,說明野生岷江百合和宜昌百合、卷丹等[8-9]類似,對一些細(xì)菌有顯著的抑制作用;此外,本研究中選取常見的導(dǎo)致人體腸道干擾的大腸桿菌和造成人體感染部位化膿的金黃色葡萄球菌[32]為參考,初步驗(yàn)證了野生岷江百合的天然抑菌能力。

表5 兩種百合鱗莖多酚提取物抑菌活性的測定

圖2 兩種百合鱗莖多酚提取物對不同細(xì)菌的抑制效果

2.5 兩種百合鱗莖多酚提取物最低抑菌濃度(MIC)的比較

由表6可知,岷江百合多酚提取物對產(chǎn)氣桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用相對較強(qiáng),其MIC均為6.25 mg·mL-1,而對大腸桿菌和變形桿菌的MIC均為12.50 mg·mL-1;蘭州百合多酚提取物對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的MIC均為25.00 mg·mL-1,而對金黃色葡萄球菌的MIC為12.50 mg·mL-1。

表6 兩種百合鱗莖多酚提取物的最低抑菌濃度(mg·mL-1)

3 結(jié)論

野生岷江百合鱗莖中總多酚、黃酮和黃烷醇的含量顯著高于傳統(tǒng)食用的蘭州百合,且兩種百合鱗莖中單體酚含量均存在顯著差異,岷江百合鱗莖中兒茶素、蘆丁、異槲皮苷以及原矢車菊素B2相比其他被檢測出單體酚的含量相對較高,而蘭州百合中原矢車菊素B2和沒食子酸含量相對較高。岷江百合鱗莖多酚源于天然植物成分,毒副作用小,具有抗氧化和抑菌雙重作用,作為天然抗氧化劑以及抗菌藥物應(yīng)用前景廣闊,值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

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