大豆11S球蛋白熱力學(xué)特性和溶液性質(zhì)與表面疏水性關(guān)系研究

李 丹,魏冬旭,賈 燁,劉春雷,江連洲

(1.寧德師范學(xué)院,福建寧德 352100;2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局,黑龍江哈爾濱 150001;3.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司,浙江杭州 310018;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

蛋白質(zhì)的表面疏水性是由于部分疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)表面引起的,是影響分子間相互作用的主要因素,是衡量蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一。蛋白質(zhì)的表面疏水性與蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性等密切相關(guān)。差示掃描量熱法(DSC)是一種研究熱性質(zhì)的有效手段,變性溫度(Td)反應(yīng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,變性焓(ΔH)是疏水作用和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密性的重要指標(biāo)[1]。溶解性是大豆蛋白質(zhì)可應(yīng)用性的重要參數(shù),是大豆蛋白質(zhì)最重要的功能特性之一,溶解性差，通常伴隨著功能特性較差[2]。溶液性質(zhì)是大豆蛋白質(zhì)實(shí)際應(yīng)用中的重要性質(zhì)之一,是大豆蛋白質(zhì)功能特性的基礎(chǔ)。溶液中可溶性聚集物的分子量及其分布以及流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布反映蛋白質(zhì)的聚集程度。ξ-電位反映蛋白質(zhì)表面電荷情況,與表面疏水性共同作用,影響蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性[3]。

近年來,大量研究表明大豆蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性隨大豆品種和產(chǎn)地的不同而有所差異[4-6],而關(guān)于大豆蛋白質(zhì)的表面疏水性與其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的關(guān)系研究報(bào)道不多,且研究大多數(shù)是以SPI(大豆分離蛋白)為對(duì)象,從純品大豆11S球蛋白的角度來研究品種差異對(duì)大豆蛋白表面疏水性的影響,探討大豆蛋白質(zhì)熱力學(xué)特性和溶液性質(zhì)與表面疏水性的關(guān)系,在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究選擇我國常用的、具有區(qū)域代表性的11個(gè)大豆品種制備的11S球蛋白為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探討大豆11S球蛋白熱力學(xué)特性和溶液性質(zhì)與表面疏水性的關(guān)系,以期為今后開發(fā)大豆蛋白質(zhì)特定功能性產(chǎn)品而進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)和重組提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 東農(nóng)42,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所;黑農(nóng)46、合豐55 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所;冀豆12 河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所;皖豆28 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所;福豆234 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所;ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸) Sigma公司;KH2PO4、K2HPO4、NaCl、β-巰基乙醇 為優(yōu)級(jí)純,其余試劑為國產(chǎn)分析純;標(biāo)準(zhǔn)蛋白(甲狀腺球蛋白、醛縮酶、牛血清白蛋白、卵白蛋白、腺苷酸激酶、激血球素) 上?？道噬锟萍加邢薰?。

AKTA-蛋白質(zhì)純化儀 美國GE公司;HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade凝膠預(yù)裝柱 美國GE公司;PE Pyris6差示掃描量熱儀 美國PULUS TA.XT公司;Zeta Plus電位及激光粒度分析儀 美國布魯克海文儀器公司;722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆前處理 不同品種大豆樣品粉碎后過40目篩,用正己烷脫脂,得脫脂大豆粉,以脫脂豆粉為原料制備大豆11S球蛋白,用凱氏定氮和SDS-PAGE電泳綜合分析其純度均在95%以上[7]，備用。

1.2.2 表面疏水性的測(cè)定 采用ANS熒光探針法,具體參照李丹[8]和劉春雷等[9]的方法測(cè)定大豆蛋白的表面疏水性。

1.2.3 熱力學(xué)特性分析 利用PE Pyris 6-DSC熱力分析儀測(cè)定不同品種大豆11S球蛋白的熱力學(xué)特性[10]。稱取5 mg的樣品放入鋁盒中,再向其中加入10 μL的pH7.6的磷酸鹽緩沖液,壓盤密封,室溫條件下放置6 h。溫度掃描范圍:20～120 ℃;升溫速率:10 ℃/min;在120 ℃保持1 min;隨后從120 ℃降溫至20 ℃,降溫速率:30 ℃/min。記錄此過程中樣品的變性溫度(Td)和變性焓變(ΔH)。

1.2.4 溶解性的測(cè)定 參考Samoto等[11]的方法。將200 mg樣品分散于20 mL去離子水中,室溫下磁力攪拌30 min,室溫離心(10000×g,20 min)。上清液經(jīng)適度稀釋,采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,吸光度橫坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 Lowry法蛋白含量測(cè)定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品溶解度(%)=上清液蛋白質(zhì)量濃度/(樣品質(zhì)量濃度×樣品蛋白質(zhì)含量)×100

1.2.5 蛋白質(zhì)溶液性質(zhì)的測(cè)定

1.2.5.1 溶液的平均分子量分布的測(cè)定 采用體積排阻-凝膠色譜(SEC-HPLC)研究不同品種大豆11S球蛋白的分子量分布。應(yīng)用AKTA-蛋白質(zhì)純化儀和HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade凝膠預(yù)裝柱,采用紫外檢測(cè)器在280 nm處檢測(cè)。流動(dòng)相為pH7.6的磷酸鹽緩沖液(2.6 mmol/L KH2PO4,32.5 mmol/L K2HPO4,0.4 mol/L NaCl,10 mmol/Lβ-巰基乙醇,離子強(qiáng)度0.5,pH7.6),在使用前經(jīng)0.22 μm水系醋酸纖維素濾膜真空抽濾處理。通過預(yù)實(shí)驗(yàn),最終確認(rèn)參數(shù)條件為流速1 mL/min,限制壓強(qiáng)0.3 MPa,柱溫25 ℃。進(jìn)樣濃度10 mg/mL,進(jìn)樣量1 mL,進(jìn)樣前樣品過0.22 μm水系醋酸纖維素濾膜處理。

選擇6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,分別為:甲狀腺球蛋白,分子量為669 kDa;醛縮酶,分子量為158 kDa;牛血清白蛋白,分子量為67 kDa;卵白蛋白,分子量為43 kDa;腺苷酸激酶,分子量為32 kDa;激血球素,分子量為17 kDa。標(biāo)準(zhǔn)曲線以洗脫體積為橫坐標(biāo),分子量的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白SEC-HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5.2 流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布的測(cè)定 采用Zeta Plus粒度分析儀測(cè)定不同品種大豆11S球蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布。將樣品用pH7.6的磷酸鹽緩沖液配制成濃度為0.2%的蛋白溶液,過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜,室溫下進(jìn)行測(cè)量,取三次測(cè)量的平均值。

1.2.5.3 ζ-電位的測(cè)定 采用Zeta Plus Zeta-電位儀測(cè)定不同品種大豆11S球蛋白溶液的ζ-電位。將樣品用pH7.6的磷酸鹽緩沖液配制成濃度為0.2%的蛋白溶液,上樣體積為1 mL,測(cè)定溫度為25 ℃。重復(fù)測(cè)量6次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS V18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析,如果方差分析差異性顯著(p<0.05),則使用Duncan進(jìn)行多重比較。采用Origin 8.0軟件等進(jìn)行圖譜分析處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面疏水性分析

如圖3所示,6個(gè)品種大豆11S球蛋白的表面疏水性指數(shù)在1432.73～1623.00之間,東農(nóng)42>合豐55>黑農(nóng)46>冀豆12>皖豆28>福豆234?？梢?品種差異對(duì)大豆11S球蛋白的表面疏水性影響極顯著(p<0.01),這可能與不同品種大豆11S球蛋白的結(jié)構(gòu)特性和理化性質(zhì)差異有關(guān)。

圖3 不同品種大豆11S球蛋白的表面疏水性

2.2 熱力學(xué)特性與表面疏水性的關(guān)系

由表1可知,6個(gè)品種大豆11S球蛋白之間的Td存在顯著性差異(p<0.01),福豆234>皖豆28>冀豆12>合豐55>黑農(nóng)46>東農(nóng)42;品種之間變性焓存在顯著性差異(p<0.01),福豆234>皖豆28>冀豆12>黑農(nóng)46>合豐55>東農(nóng)42。可見,品種差異對(duì)大豆11S球蛋白的熱力學(xué)特性影響極顯著。相關(guān)性分析表明:大豆11S球蛋白的表面疏水性與Td值呈顯著負(fù)相關(guān)(p=0.010),相關(guān)性系數(shù)為-0.918;與變性焓ΔH值呈顯著負(fù)相關(guān)(p=0.012),相關(guān)性系數(shù)為-0.908。分析其原因?yàn)?大豆11S球蛋白的熱變性溫度與變性焓較大時(shí),其熱穩(wěn)定性較高,使其完全變性所需要的能量較大,說明穩(wěn)定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵數(shù)量較多,分子結(jié)構(gòu)緊密、構(gòu)象穩(wěn)定,暴露于分子表面的疏水性氨基酸殘基較少,使其具有較低的表面疏水性。

表1 不同品種大豆11S球蛋白的DSC分析結(jié)果

2.3 溶解性與表面疏水性的關(guān)系

如圖4所示,6個(gè)品種的大豆11S球蛋白均具有良好的溶解性,溶解度在85.69%～90.41%之間,福豆234>皖豆28>冀豆12>黑農(nóng)46>合豐55>東農(nóng)42,品種差異對(duì)大豆11S球蛋白的溶解性影響極顯著(p<0.01)。相關(guān)性分析表明:大豆11S球蛋白的溶解性與表面疏水性呈極顯著負(fù)相關(guān)(p=0.003),相關(guān)性系數(shù)為-0.953。分析其原因?yàn)?影響蛋白質(zhì)溶解性的主要相互作用為疏水相互作用和離子相互作用。表面疏水性反映了蛋白質(zhì)疏水相互作用的大小,表面電荷反映了離子相互作用的大小。Bigelow指出電荷、表面疏水性是決定蛋白質(zhì)溶解性的兩個(gè)主要的特性,電荷越高、表面疏水性越低,蛋白質(zhì)溶解性越好[12]。表面電荷的多少取決于蛋白質(zhì)自身帶電荷情況和溶液的離子強(qiáng)度,因此在低離子強(qiáng)度時(shí),大豆11S球蛋白的溶解性受表面疏水性的影響較大。

圖4 不同品種大豆11S球蛋白的溶解性

2.4 溶液的平均分子量及其分布與表面疏水性的關(guān)系

如圖5所示,6個(gè)品種大豆11S球蛋白溶液的分子量分布相似,均為一個(gè)主峰和三個(gè)小峰。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白SEC-HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算,主峰分子量約為370.49～376.43 kDa,與11S球蛋白在中性pH條件下的分子量相符[13],約占總量的83.00%;第一個(gè)小峰分子量約為594.21～640.13 kDa,是11S球蛋白的二聚體15S[14],約占總量的3.00%～5.00%;第二個(gè)小峰分子量約為468.73～474.93 kDa,是11S球蛋白的單聚體[14],約占總量的11.00%～14.00%;第三個(gè)小峰分子量約為148.27～149.57 kDa,是大豆7S球蛋白[15],是大豆11S球蛋白制備過程中存留的雜質(zhì),約占總量的1.30%～1.70%,因含量極少,在基線以下,故可忽略不計(jì)。

圖5 不同品種大豆11S球蛋白溶液的分子量分布圖譜

分析結(jié)果顯示,6個(gè)品種大豆11S球蛋白溶液中可溶性聚集物的平均分子量依次為東農(nóng)42(397.73 kDa)>合豐55(395.74 kDa)>黑農(nóng)46(395.43 kDa)>冀豆12(394.99 kDa)>皖豆28(393.43 kDa)>福豆234(392.88 kDa)。相關(guān)性分析表明:大豆11S球蛋白溶液可溶性聚集物的平均分子量與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)(p=0.005),相關(guān)性系數(shù)為0.945。分析其原因?yàn)?大豆11S球蛋白的表面疏水性越小,即蛋白質(zhì)表面的疏水相互作用越弱,溶液中形成的大分子聚集物越少,可溶性聚集物體積也越小,表現(xiàn)為平均分子量越小。

2.5 流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布與表面疏水性的關(guān)系

如圖6所示,6個(gè)品種大豆11S球蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑分布相似,均呈現(xiàn)雙峰分布。分析結(jié)果顯示:峰1粒子較小,為天然大豆11S球蛋白分子;峰2粒子相對(duì)較大,為大豆11S球蛋白分子在溶液中形成的聚集體。6個(gè)品種大豆11S球蛋白溶液粒子的多分散性指數(shù)均較小,依次為東農(nóng)42(0.41)>合豐55(0.40)>黑農(nóng)46(0.39)>冀豆12和皖豆28(0.37)>福豆234(0.31),說明樣品溶液粒徑分布均勻[16]。6個(gè)品種大豆11S球蛋白溶液的平均粒子直徑依次為東農(nóng)42(143.20 nm)>合豐55(98.90 nm)>黑農(nóng)46(74.40 nm)>冀豆12(66.80 nm)>皖豆28(51.20 nm)>福豆234(40.00 nm)。相關(guān)性分析表明:大豆11S球蛋白溶液可溶性聚集物的平均直徑與表面疏水性呈顯著正相關(guān)(p=0.007),相關(guān)性系數(shù)為0.930。這是因?yàn)榇蠖?1S球蛋白的表面疏水性越小,蛋白質(zhì)分子之間的吸引力疏水相互作用越小,蛋白質(zhì)分子相互聚集的程度越小,形成的可溶性聚集物粒子越小且越均勻,從而表現(xiàn)出平均直徑越小。

圖6 不同品種大豆11S球蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑分布圖

2.6 ξ-電位與表面疏水性的關(guān)系

如圖7所示,中性pH條件下,6個(gè)品種大豆11S球蛋白溶液的ξ-電位均為負(fù)值,且差異性極顯著(p<0.01),絕對(duì)值依次為皖豆28(30.77 mV)>福豆234(30.19 mV)>冀豆12(29.02 mV)>黑農(nóng)46(28.89 mV)>合豐55(27.67 mV)>東農(nóng)42(23.09 mV)。相關(guān)性分析表明:大豆11S球蛋白的ξ-電位絕對(duì)值(即表面電荷)與表面疏水性呈顯著負(fù)相關(guān)(p=0.034),相關(guān)性系數(shù)為-0.845,說明大豆11S球蛋白具有較高表面疏水性時(shí),其溶液的ξ-電位絕對(duì)值較小,即蛋白質(zhì)表面電荷較少。這可能是由于大豆11S球蛋白表面疏水性較高時(shí),暴露于蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)數(shù)量較多,使蛋白質(zhì)表面的極性氨基酸尤其是帶電荷氨基酸相對(duì)減少,表面電荷量減少,從而使得ξ-電位絕對(duì)值較小。

圖7 不同品種大豆11S球蛋白的ξ-電位

3 結(jié)論

大豆11S球蛋白的表面疏水性與其熱力學(xué)特性具有顯著相關(guān)性,具體表現(xiàn)為:大豆11S球蛋白的表面疏水性與其變性溫度呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)性系數(shù)為-0.918;與其變性焓呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)性系數(shù)為-0.908。大豆11S球蛋白溶液在低離子強(qiáng)度時(shí),其溶解度受大豆11S球蛋白表面疏水性的影響較大,兩者呈極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)性系數(shù)為-0.953。大豆11S球蛋白的溶液性質(zhì)與其表面疏水性具有顯著相關(guān)性,具體表現(xiàn)為:大豆11S球蛋白溶液可溶性聚集物的平均分子量與其表面疏水性呈顯著正相關(guān),相關(guān)性系數(shù)為0.945;平均直徑與表面疏水性呈顯著正相關(guān),相關(guān)性系數(shù)為0.930;ξ-電位絕對(duì)值(即表面電荷)與表面疏水性呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)性系數(shù)為-0.845。

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