酶促交聯羅非魚肉重組工藝研究

施源德,楊 琴,黃迪惠,歐陽銳,陳文韜,項雷文

(福建師范大學福清分校,食品軟塑包裝技術福建省高校工程研究中心,近海流域環境測控治理福建省高校重點實驗室，福建福清 350300)

我國是漁業養殖和捕撈大國,據農業部統計2016年魚類產量高達4039萬噸,魚肉產量和加工量大,生產過程中產生的碎魚肉非常多。目前,碎魚肉多用做魚餌、魚飼料或丟棄,經濟價值不高,還會造成環境污染,因此通過加工技術使低值魚肉高值化是食品加工研究熱點。

魚肉蛋白由肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和肌基質蛋白組成,而肌原纖維蛋白又由肌球蛋白、肌動蛋白以及原肌球蛋白與肌鈣蛋白所組成,其中肌球蛋白在一定條件下會從肌原纖維中溶解出來,并可與魚肉中其他組分發生凝膠作用[1]。目前國內外學者在魚肉蛋白凝膠作用方面的研究主要集中在食品類粘合劑應用[2],如轉谷氨酰胺酶(Transglutaminase,簡寫TG)[3]、蛋白類添加物[4]、酪蛋白酸鈉(Sodium Caseinate,簡寫SC)[5]、多糖類添加物[6-7]等,其中技術上比較成熟的有酶促交聯和糖基化交聯。酶促交聯是運用酶制劑使蛋白質之間發生共價交聯[8-9],糖基化交聯則利用還原糖對蛋白質進行糖基化修飾[10]。在酶促交聯中,TG可催化蛋白質酰基化反應[11-12],即蛋白質經過TG催化后,蛋白質分子間、分子內通過共價鍵交聯在一起形成大分子物質,導致蛋白質立體結構發生改變,質構特性隨之改變,同時一些輔料,如磷酸鹽、SC、NaCl等的復配使用可對魚肉產品保水性、硬度、凝膠強度有顯著影響[13-15]。

本文以TG-S、SC和NaCl復配蛋白交聯劑研究羅非魚碎肉重組工藝,以凝膠強度作為重組魚肉質構的分析指標,在單因素實驗基礎上,用響應面分析法優化重組魚肉工藝來得到最優的復配交聯劑配方和工藝操作方案,期望本研究能提高碎魚肉的利用率和附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(用來模擬碎魚肉) 市售;氯化鈉(食品級) 中鹽福建鹽業有限公司;酪蛋白酸鈉(食品級) 河南五星生物科技有限公司;丙烯酰胺、N′N-甲雙叉丙烯酰胺 上海麥克林生化科技有限公司;谷氨酰胺轉氨酶(TG-S,酶活力約50 U/mg) 江蘇省泰興市一鳴生物制品有限公司;十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、三(羥甲基)氨基甲烷、乙酸、鹽酸、乙醇、四甲基乙二胺 國藥集團化學試劑有限公司;考馬斯亮藍 BBI生命科學有限公司;4×蛋白質上樣緩沖液(含β-巰基乙醇) 北京索萊寶科技有限公司。

EZ-S型500N質構儀 日本島津;FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;H-1850R型臺式高速離心機 湖南湘儀儀器有限公司;DYCZ-24DN型電泳槽 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶促交聯魚肉重組工藝流程 魚肉處理→解凍→拌機中空斬→添加NaCl斬拌→添加SC斬拌→加TG-S斬拌→入模定形→速凍→取出解凍,測定凝膠強度。

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 魚肉處理 羅非魚肉去除皮、刺等雜質,冰水漂洗2～3次,吸干魚肉表面水分分裝速凍,備用。

1.2.2.2 解凍 羅非魚肉解凍后,吸干魚肉表面水分,稱重取樣,斬拌機空斬5 min。

1.2.2.3 添加成分的處理及斬拌 NaCl、TG-S先用適量蒸餾水溶解,再加入肉中斬拌;SC直接加入斬拌。

1.2.2.4 入模定形 將斬拌后魚肉均勻分布于模具中,壓實。

1.2.2.5 速凍 5 ℃放置0.5 h后再放置于-18 ℃速凍24 h。

1.2.3 實驗設計

1.2.3.1 單因素實驗 為保持魚肉的營養價值和風味,所有實驗均在低溫(5 ℃)下進行。以凝膠強度作為產品評價指標,對TG-S、SC、NaCl的添加量和反應時間進行單因素實驗。

反應時間對重組魚肉凝膠強度的影響:在25 g魚肉中添加TG-S 0.9%、SC 1.1%、NaCl 1.0%,在5 ℃下反應時間分別為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h,并在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測定反應時間對重組魚肉凝膠強度的影響。

TG-S添加量對重組魚肉凝膠強度的影響:在25 g魚肉中添加SC 1.1%、NaCl 1.0%,TG-S的添加量分別為0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%,在5 ℃下反應0.5 h,并在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測定TG-S添加量對重組魚肉凝膠強度的影響。

NaCl添加量對重組魚肉凝膠強度的影響:在25 g魚肉中添加SC 1.1%、TG-S 1.2%,NaCl添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,在5 ℃下反應0.5 h,在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測定NaCl添加量對重組魚肉凝膠強度的影響。

SC添加量對重組魚肉凝膠強度的影響:在25 g魚肉中添加NaCl 2.0%、TG-S 1.2%,SC添加量分別為0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%,在5 ℃下反應0.5 h,并在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測定SC添加量對重組魚肉凝膠強度的影響。

1.2.3.2 響應面設計法優化工藝參數 以凝膠強度作為產品評價指標,運用Box-Benhnken模型的中心組合實驗設計原理,在單因素實驗的基礎上,選擇3個對凝膠強度影響顯著的因素作為自變量,采用響應面法分析并進行重組工藝配方優化,如表1所示。

表1 響應面分析因素和水平表

1.2.4 凝膠強度測定的方法 用島津EZ-S型質構儀測定重組魚肉的凝膠強度,凝膠強度=破斷強度(g)×凹陷深度(mm),單位g×mm。將重組魚肉解凍后進行凝膠強度測定,測試采用食品檢測模式,實驗類型選擇壓縮,選擇的圓柱型探頭,測前、測中、測后速度分別為120、60、120 mm/min,測量距離10 mm,每組重復3次,取平均值作為實驗結果[16]。

1.2.5 蛋白質分子凝膠電泳 純魚肉、重組魚肉制品取出解凍后稱取0.5 g,加4 mL配制好的2%SDS溶液提取蛋白,60 ℃水浴鍋加熱30 min,10000 r/min冷凍離心5 min,取上清液0.5 mL,用2%SDS提取液稀釋1倍后移取120 μL,加入40 μL的4×上樣液,95 ℃加熱5 min,3000 r/min離心2 min,取適量上清液進行電泳。

分離膠選用7.5%,濃縮膠選用4.5%;濃縮膠階段電壓80 V,分離膠階段電壓120 V;電泳結束后,用考馬斯亮藍液避光染色1 h,而后用蒸餾水清洗,再用脫色液脫色,取出膠片掃描[17-18]。

1.2.6 數據處理 本實驗數據采用Origin9、Design-Expert軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗及分析

2.1.1 反應時間對重組魚肉凝膠強度的影響 由圖1可知,5 ℃下反應隨著反應時間的延長,凝膠強度呈現先增大后減小再增大的趨勢,反應0.5 h時的凝膠強度最大。出現這種趨勢的原因可能是:隨著反應時間的進行,蛋白質交聯作用和凝膠三維結構的松弛的競爭關系導致的[19],即首先SC對蛋白質的交聯起主導作用導致凝膠強度先增大,緊接著凝膠三維結構松弛導致凝膠強度減小;而后TG-S酶對蛋白質的交聯起主導作用導致凝膠強度再增大,因此選擇反應時間為0.5 h。

圖1 反應時間對重組魚肉凝膠強度的影響

2.1.2 TG-S添加量對重組魚肉凝膠強度的影響 圖2可知,隨著酶添加量的增加,重組魚肉的凝膠強度增大,說明TG-S可使魚肉中的鹽溶性蛋白質發生交聯。當酶添加到1.2%時凝膠強度達到較高值,之后隨著酶添加量增大,凝膠強度值增加趨于平緩,這可能是因為可用于酶促交聯的底物蛋白質已基本耗盡,所以繼續增加酶的量也無法使凝膠強度增大[20]。因此選擇TG-S添加量為0.9%、1.2%、1.5%范圍內進行響應面優化實驗。

圖2 TG-S添加量對重組魚肉凝膠強度的影響

2.1.3 NaCl添加量對重組魚肉凝膠強度的影響 圖3所示,隨著NaCl添加量的增加,重組魚肉的凝膠強度先下降再增加,這可能是因為剛開始加入的NaCl使已經溶出的鹽溶性蛋白質發生變性[21],蛋白質間交聯減少,凝膠強度減小;但隨著NaCl增加到一定值時,肌原纖維細胞中的鹽溶性蛋白大量溶出,使TG-S和SC可作用的底物蛋白增多,凝膠強度增大。在NaCl添加量為2.0%后達到高峰段,因此選擇添加量為2.0%、2.2%、2.4%進行響應面優化實驗。

圖3 NaCl添加量對重組魚肉凝膠強度的影響

2.1.4 SC添加量對重組魚肉凝膠強度的影響 圖4可知,SC加入量在0～1.2%時,凝膠強度值隨著SC加入量的增加緩慢上升,這說明SC可使重組制品凝膠強度增大。SC添加量超過1.2%之后凝膠強度值反而下降,表明過多的SC并不會提高重組制品的凝膠強度,這與Kuraishi等研究結論是相吻合的[22],即可能過多SC會在魚肉制品中形成小的凝膠囊泡,削弱凝膠結構,使凝膠強度下降。因此選擇SC添加量為0.9%、1.2%、1.5%進行響應面優化實驗。

圖4 SC添加量對重組魚肉凝膠強度的影響

2.2 響應面分析法工藝參數優化

2.2.1 多元二次響應面回歸模型的建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2實驗數據做處理和分析,從中得到了各因子對響應值的二次多項回歸模型為:

表2 響應面分析實驗設計與結果

Y=-164.70+193.37A+56.37B-45.57C-4.86AB+20.71AC-7.037BC-47.30A2-16.27B2+3.44C2

對所得的回歸方程進行有效性檢驗,可知各個因素對重組產品凝膠強度影響。各因素對重組魚肉凝膠強度的影響回歸方程方差分析見表3。

由表3可知,該模型的p=0.0019<0.01,表明模型回歸效果極其顯著。模型相關系數R2=0.9742,CV=0.79,失擬項p=0.1851>0.05,表明差異不顯著,模型和實驗的擬合程度良好,因此響應面分析法所得二次方程模型可信,能夠用來指導酶促交聯魚肉重組工藝優化。

表3 回歸方程方差分析表

二次多項回歸方程中的一次項P(A)=0.0018<0.01,P(B)=0.0015<0.01,P(A)=0.0278<0.05,證明NaCl、SC、TG-S對凝膠強度效果影響顯著,其中添加NaCl、SC添加量對凝膠強度效果影響極顯著。在交互項中,P(AC)=0.0025<0.01,說明NaCl與SC交互作用對凝膠強度影響極顯著;P(BC)=0.0357<0.05,TG-S與SC交互作用對凝膠強度效果影響顯著;P(AB)=0.2456>0.05,所以NaCl與TG-S交互作用對凝膠強度效果影響不顯著;二次項A2、B2對凝膠強度的影響均極顯著(p<0.01),C2影響不顯著(p>0.05),這說明各因素交互作用對于響應值有影響,而不是簡單的線性關系。

2.2.2 響應面曲面圖分析 圖5～圖7客觀反映了各因素之間的交互作用對重組魚肉凝膠強度的影響,從圖形的陡峭形態可知,NaCl與SC添加量之間、SC與TG-S酶添加量之間的交互作用明顯;而TG-S酶與NaCl添加量之間交互作用不明顯,與表3結論基本一致。

圖5 NaCl與TG-S添加量對重組魚肉凝膠強度的影響

圖6 NaCl與SC添加量對重組魚肉凝膠強度的影響

圖7 TG-S與SC添加量對重組魚肉凝膠強度的影響

2.2.3 驗證實驗 由Design-Expert軟件的響應面分析可得到酶促交聯魚肉重組最佳條件為:NaCl為2.32%、TG-S為1.06%、SC為1.50%、反應時間0.5 h,在此條件下重組魚肉制品凝膠強度理論預測值為3493.5 g×mm 。然后根據實際情況修正為NaCl為2.3%，TG-S為1.1%，SC為1.5%反應時間0.5 h，在此條件測得的凝膠強度的值3409.5 g×mm,與理論預測值相近。

2.3 蛋白質分子凝膠電泳結果分析

重組魚肉、新鮮魚肉和標準蛋白的SDS-PAGE結果,如圖8。

圖8 重組魚肉凝膠SDS-PAGE圖譜

從圖8可知,在相對分子質量為200和40 KDa的蛋白質電泳條帶強度減少明顯,該結論與張云飛的研究相似[18],即說明復配的交聯劑催化的作用部位主要是肌球蛋白重鏈,而分子量為40 KDa條帶也減弱,這可能是NaCl使鹽析蛋白從肌肉中溶出,并在TG-S作用下與其他蛋白質發生聚合,另外,重組魚肉制品電泳條帶中肌動蛋白(Actin)、原肌球蛋白(Tm)的條帶并未發生明顯變化,說明它們并未參與TG-S的交聯作用。

3 結論

通過單因素實驗確定最佳反應時間為0.5 h,并以NaCl、TG-S、SC添加量這3個重要因素為自變量,以凝膠強度為指標,通過響應面分析法進行酶促交聯魚肉重組工藝優化,分析結果表明響應面多元二次回歸模型極顯著,不是簡單的線性關系。酶促交聯魚肉重組最佳工藝條件為:NaCl為2.3%、TG-S為1.1%、SC為1.5%、反應時間0.5 h,在此條件下重組魚肉制品凝膠強度3409.5 g×mm,與理論預測值為3493.5 g×mm相近,且重組后的魚碎肉的凝膠強度提高了1.6倍。通過SDS-PAGE,可知復配的交聯劑催化的作用部位主要是相對分子質量為200和40 KDa蛋白質分子。

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