蘭州百合鱗莖冷藏保鮮過程中碳水化合物含量及淀粉酶活性的變化

馬君義,韓小芬,陳 楠,馬 蓉,李 琴,張 繼

(1.西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心,甘肅蘭州 730070)

百合鱗莖營養豐富,具有清肺和滋陰的功效。蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolorSalisb.)不僅是百合中的上品,而且是我國四大百合品系中唯一的甜百合,被視為“蔬菜人參”,有“蘭州百合甲天下”的美譽,其食用、藥用、保健和觀賞價值很高[1-2]。以“中國百合之都”蘭州市,蘭州百合“中國優勢生態區域”七里河為中心的蘭州百合的種植面積已達66.7 km2,是種植區農民脫貧致富的支柱產業[3]。商品蘭州百合多以冷庫保鮮儲藏,真空包裝鮮食為主,鱗莖冷藏保鮮過程中的生理生化變化影響其商品屬性。已有學者探討了不同品種、不同海拔生長的百合鱗莖在不同溫度貯藏條件下形態、生理變化及其與生長發育的關系[4-7],低溫、外源激素誘導對百合鱗莖生理生化指標的影響[8-9],生長發育過程中百合營養成分含量與相關代謝酶活性的動態變化規律[10-13],以及低溫解除休眠過程中百合鱗莖營養成分含量與代謝酶活性的變化關系[14]。淀粉等碳水化合物的含量變化是表征百合鱗莖儲藏品質的重要指標之一,淀粉酶是參與淀粉代謝的重要酶類,但有關蘭州百合鱗莖冷藏保鮮過程中生理生化變化的研究資料還很缺乏。

本研究以蘭州百合鱗莖為試材,探討了-2 ℃冷藏保鮮過程中百合鱗莖內可溶性糖、還原糖、淀粉的含量與總淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性的變化,以期為明確蘭州百合鱗莖采后冷藏保鮮的淀粉代謝機理、調節碳水化合物積累與分配提供依據,為蘭州百合鱗莖的采后冷藏保鮮提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州百合鱗莖 2016年3月采自甘肅地泰農業有限公司百合種植基地;麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、可溶性淀粉、石英砂、氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃硫酸、高氯酸、結晶酚、酒石酸鉀鈉、蒽酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硫酸氫鈉、3,5-二硝基水楊酸等 均為分析純。

UV-9100B型紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;BCD-262WDGB型三開門冰箱 青島海爾股份有限公司;JRA-6型數顯磁力攪拌水浴鍋 江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司;CT15RT型低溫超速離心機 天美(中國)科學儀器有限公司;AW320型電子天平 Shimadzu corporation;玻璃儀器氣流烘干器 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 選取鱗片抱合緊密、無病蟲害、鱗莖盤無損傷、大小均勻的蘭州百合鱗莖,清刷泥土,剝離百合鱗片后,清洗并用濾紙吸干其表面水分,裝入密閉的玻璃容器中,模擬蘭州百合加工企業冷藏保鮮條件于-2 ℃冰箱中保存,每10 d測定一次百合鱗莖中淀粉、可溶性糖、還原糖的含量以及淀粉酶的活性,連續測定60 d。所有樣品測定前經液氮凍干后用研缽快速研磨成粉末,精密稱定,待測。

1.2.2 碳水化合物含量的測定

1.2.2.1 蔗糖標準曲線與回歸方程的建立 采用蒽酮試劑法[15]。準確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 200 μg/mL的蔗糖標準溶液于7支刻度試管中,加蒸餾水至2 mL,依次加入0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯試液、5 mL濃硫酸,經渦旋振蕩后,迅即置沸水浴中逐管準確保溫1 min,取出并自然冷卻至室溫后,以空白為對照,利用紫外-可見分光光度計測定其在630 nm處的吸光值。以蔗糖質量(M)對吸光度(A)作圖并采用最小二乘法進行線性回歸,得回歸方程。

1.2.2.2 葡萄糖標準曲線與回歸方程的建立 采用3,5-二硝基水楊酸法[16]。準確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 1 mg/mL的葡萄糖標準溶液于25 mL容量瓶中,用蒸餾水補至1.0 mL,分別加入DNS試劑2 mL,經渦旋振蕩后,迅即置沸水浴中逐管準確保溫5 min,流水冷卻,用蒸餾水定容至刻度。以空白為對照,利用紫外-可見分光光度計測定其在540 nm處的吸光值。以葡萄糖質量(M)對吸光度(A)作圖并采用最小二乘法進行線性回歸,得回歸方程。

式中:M為標準曲線求得的可溶性糖含量(μg);Vt為提取液的體積(mL);V1為測定時取用樣品液體積(mL);W為樣品質量(g);D為稀釋倍數。

1.2.2.4 還原糖含量的測定 吸取1.2.2.3所得蘭州百合可溶性糖提取液3 mL于25 mL容量瓶中,加入DNS試劑2.0 mL,經渦旋振蕩后,迅即置沸水浴中保溫5 min,取出,流水冷卻,用蒸餾水定容至刻度。照1.2.2.2所述測定吸光度,并計算蘭州百合的還原糖含量。

式中:M為標準曲線求得的還原糖含量(μg);Vt為提取液的體積(mL);V1為測定時取用樣品液體積(mL);W為樣品質量(g);D為稀釋倍數。

1.2.2.5 淀粉含量的測定 向1.2.2.3提取可溶性糖后的沉淀中加入3 mL蒸餾水,渦旋振蕩后,迅即置沸水浴中糊化15 min。取出,流水冷卻,加入2 mL冷的9.2 mol/L高氯酸,攪拌提取15 min,加蒸餾水至10 mL,于4 ℃下以10000 r/min離心10 min,轉移上清液至25 mL容量瓶中。重復提取3次,上清液定容至刻度即得蘭州百合淀粉提取液。吸取樣品提取液0.5 mL,照1.2.2.1所述測定吸光度,并計算蘭州百合的淀粉含量。

1.1.3 氣胸或血氣胸 由穿刺針誤入胸腔刺破肺臟和/或鎖骨下動脈所致，為嚴重并發癥。氣胸發生率為1.5%。

1.2.3 淀粉酶活性的測定

1.2.3.1 麥芽糖標準曲線與回歸方程的建立 采用3,5-二硝基水楊酸法[16-17]。準確吸取0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.4、1.8 mL,1 mg/mL的麥芽糖標準溶液于25 mL容量瓶中,用蒸餾水補至2.0 mL,分別加入DNS試劑2 mL,經渦旋振蕩后,迅即置沸水浴中保溫5 min,流水冷卻,用蒸餾水定容至刻度。以空白為對照,利用紫外-可見分光光度計測定其在540 nm處的吸光值。以麥芽糖質量(M)對吸光度(A)作圖并采用最小二乘法進行線性回歸,得回歸方程。

1.2.3.2 淀粉酶粗提液的制備 稱取一定質量的經液氮凍干處理的蘭州百合鱗片粉末,置于經液氮預冷的陶瓷研缽中,按1∶4 (w∶v)的體積比加入0.1 mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液和少量的石英砂,快速研磨,將勻漿液轉至離心管中,再加入一定體積的上述緩沖液,分次將殘余液沖入離心管中,于4 ℃下以12000 r/min離心30 min,所得上清液用蒸餾水定容至25 mL容量瓶中,即為蘭州百合淀粉酶粗提液[16-17]。

1.2.3.3 淀粉酶總活性的測定 取5支20 mL的具塞刻度試管并按0～4編號,其中0號為空白組,1號為對照組,2～4號為實驗組。取1.0 mL蘭州百合淀粉酶粗提液加至1～4號試管中,0號試管加入等體積的0.1 mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液,再向各試管中加入1.0 mL檸檬酸緩沖液并搖勻,于40 ℃的恒溫水浴鍋中保溫15 min,隨后,向0號、2號、3號、4號試管中加入1%的淀粉溶液2.0 mL,1號試管中加入同體積的檸檬酸緩沖液,繼續40 ℃下保溫5 min,再向各試管中加入0.4 mol/L的氫氧化鈉溶液4 mL,以終止酶的活性。取上述酶促反應液2 mL,加入DNS試劑2 mL,沸水浴5 min,然后置冰浴中快速冷卻,用蒸餾水定容至8 mL,在波長540 nm下測定其吸光度[16-17]。根據1.2.3.1所得回歸方程計算麥芽糖含量,并依下式計算蘭州百合淀粉酶的總活性。

式中:W為百合鮮重(g);t為反應時間(min);D為稀釋倍數。

1.2.3.4α-淀粉酶活性的測定 取5支20 mL的具塞刻度試管并按0～4編號,其中0號為空白組,1號為對照組,2～4號為實驗組。取1.0 mL蘭州百合淀粉酶粗提液加至1～4號試管中,0號試管加入等體積的0.1 mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液,于70 ℃的恒溫水浴鍋中保溫15 min以鈍化β-淀粉酶的活性,然后置冰水浴中快速冷卻,再向各試管中加入1.0 mL的檸檬酸緩沖液,搖勻。將各試管置于40 ℃的恒溫水浴鍋中保溫15 min,隨后,向0、2、3、4號試管中加入1%的淀粉溶液2.0 mL,1號試管中加入同體積的檸檬酸緩沖液,繼續40 ℃下保溫5 min,再向各試管中加入0.4 mol/L的氫氧化鈉溶液4 mL,以終止酶的活性。取上述酶促反應液2 mL,加入DNS試劑2 mL,沸水浴5 min,然后置冰水浴中快速冷卻,用蒸餾水定容至8 mL,在波長540 nm下測定其吸光度[16-17]。根據1.2.3.1所得回歸方程計算麥芽糖含量,并計算蘭州百合α-淀粉酶的活性。

1.2.3.5β-淀粉酶活性的測定 從蘭州百合淀粉酶總活性中扣除α-淀粉酶的活性,即為β-淀粉酶的活性[16-17]。

1.3 數據處理與統計分析

2 結果與討論

2.1 蔗糖、葡萄糖與麥芽糖標準曲線

依照1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.3.1所述方法,分別以蔗糖、葡萄糖、麥芽糖質量(M)對吸光度(A)作圖并采用最小二乘法進行線性回歸,所得回歸方程、相關系數以及線性范圍如表1所示。

表1 蔗糖、葡萄糖與麥芽糖標準曲線

2.2 蘭州百合鱗莖冷藏過程中碳水化合物含量的變化

2.2.1 可溶性糖含量的變化 可溶性糖是代謝的中間產物,可通過淀粉降解來補充,又可作為呼吸底物而消耗。由圖1可知,在-2 ℃、60 d的冷藏條件下,蘭州百合鱗莖中可溶性糖含量一直保持較高水平,且隨著冷藏時間的延長可溶性糖含量逐漸增加,由剛冷藏時的18.62%增加到19.03%,增幅為2.22%,并在40～50 d時出現躍升(p<0.01),這一趨勢與“黃天霸”百合、郁金香鱗莖4～5 ℃冷藏過程中可溶性糖含量的變化規律基本一致[18-19]。

圖1 蘭州百合鱗莖冷藏過程中可溶性糖含量的變化

2.2.2 還原糖含量的變化 由圖2可知，在-2 ℃低溫冷藏的60 d內,隨著冷藏時間的延長,蘭州百合鱗莖中還原糖含量與可溶性糖含量的變化趨勢一致,呈上升趨勢。冷藏0～20 d時,還原糖含量增幅較小,20～30、40～50 d時,還原糖含量出現躍升,增加較多(p<0.01),冷藏60 d時,還原糖含量達到最高值。蘭州百合鱗莖中還原糖含量較低,整個冷藏期內還原糖含量的變化幅度較小,其含量僅增加1.39%,還原糖含量的變化體現了百合鱗莖淀粉代謝與呼吸代謝中碳水化合物的分解與轉化。

圖2 蘭州百合鱗莖冷藏過程中還原糖含量的變化

2.2.3 淀粉含量的變化 淀粉是百合鱗莖貯藏碳水化合物的一種形式,對于維持百合生長過程中碳水化合物平衡起著重要的作用。從圖3可以看出,蘭州百合鱗莖內的淀粉含量在-2 ℃、60 d的冷藏保鮮期內隨著冷藏時間的延長呈現出明顯的下降趨勢,至貯藏第60 d時的淀粉含量比開始貯藏時下降了62.29%,夏宜平[20]、孫紅梅[21]等也有類似的研究報道。百合鱗莖內淀粉含量的降低,表明百合鱗莖在低溫環境下其淀粉開始迅速轉化。

圖3 蘭州百合鱗莖冷藏過程中淀粉含量的變化

綜合分析圖1～圖3表明,蘭州百合鱗莖冷藏期間淀粉與可溶性糖及還原糖之間存在著此消彼長的關系。在-2 ℃低溫誘導作用下,淀粉等貯藏態碳水化合物開始轉化,含量持續下降,而可溶性糖和還原糖含量增加,這說明冷藏過程中百合鱗莖的淀粉轉化成能被分解利用的糖,出現了“低溫糖化”現象[21],但百合鱗莖外觀上沒有形態和結構的顯著變化。

2.3 蘭州百合鱗莖冷藏過程中淀粉酶活性的變化

從圖4可以看出,β-淀粉酶是蘭州百合鱗莖中的主要淀粉酶,其活性相對較高,且β-淀粉酶的活性隨著冷藏時間的延長而有所降低,而α-淀粉酶的活性隨著冷藏時間的延長先降低后升高,總淀粉酶在高活性的基礎上整體呈現出降低的趨勢。

圖4 蘭州百合鱗莖冷藏過程中淀粉酶活性的變化

孫紅梅[22]研究了2、6、10 ℃條件下,70%含水量的鋸木屑保濕貯藏101 d蘭州百合中部鱗片物質變化的生理機制,發現中部鱗片在貯藏的101 d內淀粉含量下降了50%左右,同時,處理溫度越低,越有利于鱗片中淀粉的降解,且淀粉酶活性隨貯藏溫度的降低而升高,隨貯藏時間的延長先增大后減小。寧國龍[23]分析了郁金香種球-5 ℃低溫冷藏處理9周的淀粉酶活性變化規律,發現隨冷藏時間的延長淀粉酶活性呈增大趨勢。本研究在-2 ℃低溫冷藏蘭州百合60 d,發現β-淀粉酶的活性隨著冷藏時間的延長而有所降低,α-淀粉酶的活性隨著冷藏時間的延長先降低后升高,總淀粉酶在高活性的基礎上整體呈現出降低的趨勢。糖類化合物含量及糖代謝相關酶的變化規律可能因冷藏溫度、冷藏時間、研究對象品種的不同而存在差異,有關蘭州百合鱗莖冷藏保鮮過程中碳水化合物含量與糖代謝相關酶的變化規律還需要進一步的研究。

2.4 蘭州百合鱗莖冷藏過程中碳水化合物含量與淀粉酶活性的相關性分析

為明確蘭州百合鱗莖冷藏過程中碳水化合物與淀粉酶的作用機理,本研究對鱗莖中可溶性糖、還原糖、淀粉及總淀粉酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶的相關性進行了統計分析(表2)。

從表2可以看出,鱗莖中糖分含量及相關酶活性之間的相關性差異水平有所不同。可溶性糖、還原糖、淀粉含量與總淀粉酶活性的相關系數在0.01水平上分別為-0.969**、-0.972**和0.982**,與β-淀粉酶活性的相關系數在0.01水平上分別為-0.961**、-0.973**和0.978**,表明總淀粉酶、β-淀粉酶活性與可溶性糖、還原糖含量具有極顯著負相關性,而與淀粉含量具有極顯著正相關性;與α-淀粉酶活性的相關系數分別為0.594、0.649和-0.623,表明α-淀粉酶活性與可溶性糖、還原糖、淀粉含量具有相關性但不顯著。總淀粉酶、β-淀粉酶活性與淀粉含量呈正相關,且總淀粉酶活性與β-淀粉酶活性的相關系數在0.01水平上呈極顯著正相關(0.989**),二者都是促進淀粉降解的。

表2 蘭州百合鱗莖冷藏過程中碳水化合物含量與淀粉酶活性的相關性分析

可溶性糖含量與還原糖、淀粉含量之間、還原糖含量與淀粉含量之間的相關系數在0.01水平上分別為0.973**、-0.945**和-0.974**,表明可溶性糖含量與還原糖含量間具有極顯著正相關性,可溶性糖、還原糖含量與淀粉含量間具有極顯著負相關性,說明淀粉的降解有利于可溶性糖和還原糖含量的升高。蘭州百合鱗莖內貯存的淀粉在低溫處理過程中逐漸轉化為可溶性糖和還原糖,這種“低溫糖化”反應與百合鱗莖細胞內淀粉酶尤其是β-淀粉酶密切相關。

3 結論

淀粉和可溶性糖是維持百合鱗莖發育過程中碳水化合物平衡的主要物質,尤其是糖含量的變化是百合鱗莖低溫貯藏條件下較為敏感的生理代謝指標之一。研究結果表明,在-2 ℃、60 d的冷藏期內,隨著冷藏時間的延長,蘭州百合鱗莖內淀粉含量明顯下降,可溶性糖和還原糖含量逐漸增加,在低溫處理40 d左右是上述物質變化最活躍的時期。相關性分析表明,總淀粉酶、β-淀粉酶活性與可溶性糖、還原糖含量具有極顯著負相關性,而與淀粉含量具有極顯著正相關性。蘭州百合鱗莖細胞內淀粉酶尤其是β-淀粉酶與淀粉降解成可溶性糖和還原糖密切相關。

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