煙曲霉素發酵培養基的優化

王昊鵬,吳黎明,趙柳微,倪 輝,肖安風,張中印,*

(1.河南科技學院資源與環境學院,河南新鄉 453003;2.中國農業科學院蜜蜂研究所,北京 100093;3.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021)

煙曲霉素(Fumagillin)是一種重要的生理活性物質,是由煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)產生的次級代謝產物并具有高效的抗菌、抗蟲和抗癌抗腫瘤作用。Hanson等[1]在1949年第一次從編號為H-3的曲霉菌株中分離得到煙曲霉素,在發現之初就被用作抗菌抗蟲藥物(抗阿米巴藥)[2]。Mccowen等[3]首次提到煙曲霉素對蜜蜂微孢子蟲病(ApisNosema)有預防作用,在美國、加拿大等養蜂發達國家,煙曲霉素已被用于治療蜜蜂微孢子蟲病,并獲得了良好的治療效果[4]。煙曲霉素是當前治療蜜蜂微孢子蟲病的唯一有效藥物[5],也可用于治療魚類的小孢子蟲病[6-7];此外,煙曲霉素能夠顯著降低脂肪量改善由于飲食誘導的肥胖癥[8],有望成為減肥新藥物。同時煙曲霉素能夠抑制新生血管的生成[9],具有抑制腫瘤生長的作用[10-11]。煙曲霉素結構復雜,性質不穩定,易發生熱降解和紫外降解[12-13],化學合成過程復雜[14],主要是通過微生物發酵獲得。由于知識產權和貿易保護等原因,目前國內煙曲霉素發酵生產研究尚屬空白,尚未實現產業化發酵生產。

發酵優化工藝是提高微生物發酵產量的有效方法。響應面分析法(Response surface methodology,RSM)是優化發酵工藝的一種高效方法,廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業等領域[15-17]。

本研究以工業發酵常見碳、氮源為基礎,通過單因素實驗及響應面實驗對煙曲霉素的培養基成分進行優化,以提高煙曲霉素的發酵產量,為煙曲霉素產業化發酵生產研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙曲霉CEA-1701(AspergillusfumigatusCEA-1701) 中國農科院蜜蜂研究所提供；煙曲霉素標準品 北京百靈威科技有限公司;色譜純甲醇 美國Tedia公司;玉米粉 漳州閩成玉米制品有限公司;消泡劑 按照泡敵∶植物油∶水(V/V/V)=1∶1∶3配制,其中泡敵取自廈門匯盛生物有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

WFJ7200型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;REC5004V21型層析柜 賽默飛世爾科技(上海)公司;BS223S型電子分析天平 德國賽多利科學儀器(北京)有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;ZWYR-D2403型恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;pH計PE20實驗室 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LC-20AT型高效液相色譜儀和Inertsustain ? C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱 島津公司。

1.2 培養基

PDA培養基:土豆洗凈切絲,稱取200 g,使用電磁爐加水煮沸30 min,待冷卻后,過200目篩濾去濾渣,添加20 g葡萄糖,15 g瓊脂,定容至1000 mL,1×105Pa滅菌20 min。

初始發酵培養基:蔗糖30 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.013 g/L、K2HPO41.0 g/L、玉米粉2.0 g/L,初始pH為6.0±0.5,1×105Pa滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 初始發酵條件 裝液量為50 mL的250 mL錐形瓶,玻璃珠10顆,接種量為裝液量的1%,培養溫度30 ℃,轉速180 r/min,培養周期144 h。

1.3.2 單孢子菌懸液的制備 將4 ℃貯藏的菌種接種到PDA斜面培養基上,28 ℃培養5～7 d得到成熟孢子。無菌操作下,用無菌生理鹽水洗下孢子,倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中,充分振蕩30 min。待孢子充分打散后,測菌懸液OD600值,并用無菌生理鹽水調整其OD600至2.0,即得單孢子菌懸液[18]。

1.3.3 接種及發酵 將制得的單孢子菌懸液于4 ℃層析柜中靜置,同步培養1 h后取出;待溫度升至室溫,以裝液量1%的接種量接種至裝有50 mL培養基的250 mL錐形瓶中,在30 ℃、180 r/min的條件下培養144 h。

1.3.4 最適碳源氮源的篩選

1.3.4.1 碳源篩選 保持搖瓶初始發酵培養基其他成分不變,并固定碳源含碳量為12.6 g/L,分別以蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、一水麥芽糖為單一碳源,每組3個平行,發酵培養144 h,取發酵液于5000 r/min離心10 min,測定發酵液中煙曲霉素含量。

1.3.4.2 氮源篩選 分別以酵母提取粉、尿素、胰蛋白胨、硝酸鈉、牛肉膏、硫酸銨為單一氮源,并固定各氮源的質量濃度為3.0 g/L,其他物質添加量同初始發酵培養基保持一致,每組3個平行,發酵培養144 h,取發酵液于5000 r/min離心10 min,測定發酵液中煙曲霉素含量。

1.3.5 單因素實驗

1.3.5.1 甘油濃度篩選 在上述碳源和氮源的基礎上,保持初始發酵培養基其他成分不變,在1.3.1所述的發酵條件下,考察0、10、20、30、40 g/L這5個不同甘油濃度對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響。

1.3.5.2 酵母提取粉濃度篩選 在以甘油30 g/L添加量時,保持初始發酵培養基其他成分不變,在1.3.1所述的發酵條件下,考察不同酵母提取粉濃度0、1、2、3、4、5 g/L對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響。

1.3.5.3 玉米粉濃度篩選 在以甘油30 g/L和酵母提取粉3 g/L添加量時,保持初始發酵培養基其他成分不變,在1.3.1所述的發酵條件下,考察不同玉米粉濃度0、1.5、2、2.5、3 g/L對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響。

1.3.5.4 鎂離子濃度篩選 在以甘油30 g/L、酵母提取粉3 g/L和玉米粉1.5 g/L添加量時,保持初始發酵培養基其他成分不變,在1.3.1所述的發酵條件下,考察不同MgSO4·7H2O濃度0、0.25、0.5、0.75、1 g/L對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響。

1.3.5.5 磷酸根離子濃度篩選 在以甘油30 g/L、酵母提取粉3 g/L、玉米粉1.5 g/L和MgSO4·7H2O 0.5 g/L添加量時,保持初始發酵培養基其他成分不變,在1.3.1所述的發酵條件下,考察不同K2HPO4濃度0、0.5、1、1.5、2 g/L對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響。

1.3.5.6 氯化鉀濃度篩選 在以甘油30 g/L、酵母提取粉3 g/L、玉米粉1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L和K2HPO40.5 g/L添加量時,保持初始發酵培養基其他成分不變,在1.3.1所述的發酵條件下,考察不同KCl濃度0、0.5、1、1.5、2 g/L對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響。

1.3.6 Plackett-Burman(PB)實驗設計 按照最適碳源、氮源配制培養基,根據單因素實驗結果,對甘油、酵母提取粉、玉米粉、MgSO4·7H2O、K2HPO4和KCl在內的6個因素運用Minitab 17.0軟件設計PB實驗(n=12),測定144 h后發酵液中煙曲霉素的含量,從而有效地篩選出對煙曲霉素生產影響較大的因素,PB實驗設計因素及水平如表1。

表1 Plackett-Burman實驗設計因素及水平(g/L)

1.3.7 Box-Behnken Design(BBD)實驗設計 在PB和單因素實驗的基礎上,用Deign-Expert 8. 0. 6軟件對PB實驗得到的顯著因素進行BB設計,并對實驗結果進行分析,以獲得最佳培養基配比,BBD實驗因素與水平如表2。

表2 Box-Behnken 實驗因素與水平(g/L)

1.3.8 生物量的測定 準確移取5 mL發酵液于室溫下5000 r/min離心10 min,然后轉移、保存上清液測定煙曲霉素的含量,將沉淀的菌體用蒸餾水清洗3次后于80 ℃烘箱內烘干至恒重,稱重,統計生物量。

1.3.9 煙曲霉素測定方法 樣品處理:發酵液于室溫下5000 r/min離心10 min后,取上清液,通過0.22 um的濾膜過濾于進樣瓶中,過程盡量避光。

色譜分析條件:Inertsustain ? C18反相柱,350 nm波長,柱溫25 ℃,進樣20 μL,流速0.8 mL/min;流動相為水(A)、甲醇(B),溶劑的梯度洗脫程序是:0～2 min,A/B(V/V)=80/20;2～5 min,A/B(V/V)=70/30;5～15 min,A/B(V/V)=30/70;15～25 min,A/B(V/V)=10/90;25～27 min,A/B(V/V)=10/90;27～28 min,A/B(V/V)=80/20;28～40 min,A/B(V/V)=80/20。

煙曲霉素標準曲線繪制:以煙曲霉素標準品1000 mg/L為母液,甲醇色譜純為溶劑,稀釋成不同濃度的標準溶液5、10、20、40、80、100、150、200 mg/L,每個梯度做5個平行。在色譜條件下進行HPLC分析,以各標準品的峰面積y對其濃度x(mg/L)進行線性回歸分析,得到標準曲線回歸方程為y=209858x-12376,相關系數R2=0.9998。以峰面積為橫坐標,根據回歸方程計算煙曲霉素濃度。

1.4 數據統計方法

實驗數據為3次平行實驗的平均值,用Excel軟件計算平均值和標準偏差,用SPSS對各指標包括碳源、氮源、無機鹽在內的幾個因素進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 碳源和氮源的篩選

碳源是微生物細胞結構及代謝產物中碳架結構的主要來源，為微生物的正常生長和細胞的分裂提供了物質基礎,適宜的碳源濃度有利于微生物的繁殖代謝；氮是組成細胞中核酸和蛋白質的重要元素,適宜的碳源、氮源直接影響著代謝產物煙曲霉素的合成。不同碳源、氮源對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響結果圖1所示。

圖1 不同碳源、氮源對煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的影響

由圖1(a)可知5種碳源發酵均能生成煙曲霉素,以甘油作為碳源時煙曲霉素產量最高，為58.45 mg/L,其次是可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖。可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖作為碳源發酵時煙曲霉素產量無顯著性差異。根據生物量變化可知,可溶性淀粉作為發酵碳源較其它碳源獲得了較高的生物量產量,但煙曲霉素產量低于甘油作為碳源時的煙曲霉素產量,這可能跟實際發酵操作中可溶性淀粉作為碳源發酵液易出現菌體結團有關,導致煙曲霉素產量降低。這跟吳升山等[18]在優化黑曲霉發酵條件時在發酵培養基中加入玻璃珠以獲得松散的菌絲體提高細胞產量的觀點相同。因此，甘油更有利于煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素。

圖1(b)反映出以酵母提取粉作為單一氮源時煙曲霉素和生物量同時獲得了最高產量。氮源有速效氮源和遲效氮源之分,對比7種氮源可以看出:煙曲霉在不同氮源條件下都能正常生長,有機氮源作為遲效氮源更有利于煙曲霉素的生產,這可能跟有機氮源中含有豐富的氨基酸、蛋白質、小分子肽有關。氨基氮源不利于煙曲霉素的生產,這可能是由于氨基氮源引入后導致發酵液pH升高不利于生成煙曲霉素。

Wen等[19]以煙曲霉NRRL2436為生產菌株篩選煙曲霉素生物合成的最佳碳源氮源,研究發現最佳的碳源組合為木聚糖30 g/L和甘露糖50 g/L,最佳氮源為L-谷氨酸9 g/L,同時指出銨鹽類物質不適宜作為氮源。與本實驗的結果有一些相似之處,有機氮源較無機氮源更利于煙曲霉素的生成,銨鹽類氮源氯化銨不利于煙曲霉素的生成。最適碳源的不同可能是不同菌株特異性的表現。

綜上所述,適宜于煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的適宜碳源和氮源分別為:甘油和酵母提取粉。

2.2 初始培養基單因素優化

甘油、酵母提取粉、玉米粉、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KCl不同添加量對煙曲霉CEA-1701發酵產煙曲霉素的影響,結果如圖2所示。

圖2 不同因素對煙曲霉素產量的影響

從圖2(a)可以看出,在以甘油作為單一碳源發酵生產煙曲霉素時,30 g/L的添加量有利于煙曲霉素合成產量達到50.15 mg/L,對應的生物量達到6.98 g/L。當甘油添加量偏離最適添加量時,煙曲霉素產量都有所降低。圖2(b)以酵母提取粉為氮源,在培養基中加入酵母提取粉明顯提高了生物量的產量,隨著酵母提取粉添加量的增加,煙曲霉素產量得到提高,在添加量為3 g/L時,煙曲霉素產量達到最高即51.35 mg/L,添加量繼續增加煙曲霉素產量反而下降,這可能是因為過量的氮源導致菌體徒增,溶氧降低不利于后期煙曲霉素的合成。王胤等[20]在研究三峽庫區煙曲霉IMB-SX28次級代謝產物時指出,1%的玉米漿添加量提高了次級代謝產物的產量。玉米漿作為生物素,不僅能夠提供微生物生長所需的微量元素,同時還能作為有機氮源,適宜的添加量能夠提高次級代謝產物的產量。本研究以玉米粉代替玉米漿,由圖2(c)可以看出玉米粉的添加可以顯著提高煙曲霉素和生物量產量。在添加量為1.5 g/L時更有利于煙曲霉素的生成即達到55.24 mg/L,此后隨著添加量的增加煙曲霉素和生物量產量無顯著性差異。MgSO4·7H2O、K2HPO4適宜的添加量都有利于煙曲霉素產量的提高,但是組間的差異性不顯著,分別以0.5 g/L和1.5 g/L添加量時煙曲霉素產量達到最高為48.88 mg/L和61.58 mg/L。適宜的KCl添加量能夠提高煙曲霉素的產量,圖2(f)可以看出煙曲霉素產量隨著氯化鉀添加量的增加呈現出先增后減的趨勢,添加量為0.5 g/L時煙曲霉素產量達到62.22 mg/L,之后隨著氯化鉀添加量的增加煙曲霉素產量反而下降,這可能是過高的鹽濃度改變了細胞膜的通透性[21]導致煙曲霉素產量降低。

通過以上實驗得到煙曲霉素發酵培養基配方為:甘油30 g/L、酵母提取粉3.0 g/L、玉米粉1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO41.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.013 g/L。

2.3 Plackett-Burman(PB)實驗設計及結果分析

運用Minitab 17.0軟件,選取甘油、酵母提取粉等影響煙曲霉素產量的6個因素進行考察,PB實驗設計及結果如表3所示。PB設計主效應分析如表4所示,可以看出影響煙曲霉素產量的重要因素為甘油、玉米粉和酵母提取粉,其中甘油的主效應極顯著(p<0.01),其次為玉米粉和酵母提取粉。因此,將甘油、玉米粉、酵母提取粉這3個培養基組分作為主要因素做進一步的響應面法優化。

表3 Plackett-Burman實驗設計及結果

表4 Plackett-Burman設計主效應分析(g/L)

2.4 Box-Behnken Design(BB)實驗設計及結果分析

煙曲霉素培養基成分配方的Box-Behnken設計及結果分析,用Deign-Expert 8. 0. 6軟件對實驗方案進行Box-Behnken設計,結果見表5。

表5 BBD實驗設計及結果

以煙曲霉素濃度為響應值A,通過Design-Expert 8. 0. 6軟件對實驗結果進行分析,得到響應值A和因素X之間的回歸方程為:

以上二次多項回歸方程的方差分析和顯著性檢驗結果見表6。

表6 回歸方程的方差分析及其系數顯著性檢驗

用Design Expert 8.0.6軟件根據回歸方程進行繪圖分析,得到響應曲面圖和等高線圖(如圖3～圖5所示)。響應曲面圖將任意兩個自變量對響應值的影響直觀地反映在球面上,響應值的最大值位于球面的最高點,等高線形狀反映兩個自變量的交互作用[22-23]。由圖3～圖5可知，X1X3對響應值的等高線形狀呈橢圓形,這表明兩個自變量間有一定的交互效應,X1X2和X2X3的交互作用較弱。

圖3 甘油及酵母提取粉添加量影響煙曲霉素的響應面圖及等高線圖

圖4 甘油及玉米粉添加量影響煙曲霉素的響應面圖及等高線圖

圖5 酵母提取粉及玉米粉添加量影響煙曲霉素產量的響應面圖及等高線圖

對回歸方程用Design Expert 8.0.6軟件分析求出最佳值,得到極值點坐標X1=3.35,X2=0.31,X3=0.17時相應因素的對應值分別為:甘油33.5 g/L、酵母提取粉3.1 g/L、玉米粉1.7 g/L,預測響應值144 h煙曲霉素濃度為66.3554 mg/L。以此條件進行驗證實驗，發酵培養煙曲霉,發酵144 h測得發酵液中煙曲霉素濃度為68.51 mg/L(比預測值高3.25%),如圖6較培養基優化前煙曲霉素產量提高了122.4%。

圖6 培養基優化前后煙曲霉素產量對比

3 結論

碳源、氮源的篩選實驗確定了適宜煙曲霉CEA-1701產煙曲霉素的碳氮源分別為甘油和酵母提取粉。在單因素實驗的基礎上采用PB分析和BBD設計響應面實驗,通過建立模型得到較優的搖瓶發酵培養基。優化后的培養基組成為:甘油33.5 g/L、酵母提取粉3.1 g/L、玉米粉1.7 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO41.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.013 g/L。最后利用優化后的培養基在實驗室條件下進行發酵培養,煙曲霉CEA-1701煙曲霉素生成量達到68.51 mg/L,較培養基優化前提高了122.4%。

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