植物生長調節劑促進蛹蟲草液體表面培養生產蟲草素

湯佳鵬,汪建雄

(1.南通大學航海醫學研究所,生化與藥學研究室,江蘇南通 226019;2.南通大學生命科學學院,生物工程系,江蘇南通 226019)

蛹蟲草是一種歷史悠久的著名中藥,現在作為新資源食品和一類新藥已獲得衛生部和國家食品藥品監督管理局批準進入市場[1]。蟲草素是蛹蟲草中最重要的生理活性物質之一,具有多種藥理學活性,包括免疫調節、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂等,因此越來越受到人們的重視[2]。目前,蛹蟲草液體發酵中蟲草素分泌于胞外可直接進行提取,優于固體發酵而被廣泛研究。鐘建江等[3]利用液體深層發酵和添加小分子效應物的方法,蟲草素產量達到596.59 mg/L。路等學等[4]利用振蕩和靜置的發酵方式液體發酵蛹蟲草,蟲草素產量達到936.225 μg/mL。Sakakibara等[5-8]通過長期研究利用離子束誘變菌株,采用液體表面培養(即靜置發酵)代替液體深層發酵,添加前體物質,優化培養基的方法,蟲草素產量達到14.3 g/L,已經成為大規模蛹蟲草發酵的主流。本實驗室采用液體表面培養,通過優化發酵培養基,蟲草素產量達到6.5 g/L[9],但是液體表面發酵菌體生長緩慢,且蟲草素產量仍較日本水平低,已經成為制約我國蛹蟲草及蟲草素進一步研究開發利用的瓶頸[10]。

植物生長調節劑以其特殊的生理調控機制,能夠通過影響生物的生長發育,達到增加產量、優化品質、代謝調節等目的，已經在固態發酵和液體深層發酵蛹蟲草中被深入研究[11-14]。通過添加2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸能夠促進蟲草素的積累;玉米素、吲哚乙酸的添加能夠加快子實體生長及增加子實體多糖含量。三十烷醇是一種從蜂蠟中提取的天然的長碳鏈植物生長調節劑,且作用靶點多元化,既能增加細胞膜的透性,又能激活葡萄糖-6-磷酸脫氫酶[4];赤霉素是一種產自真菌赤霉菌的激素,本研究所采用的菌株也屬于真菌;6-BA,即6-芐基腺嘌呤是一種腺嘌呤的衍生物,而本研究的主要產物蟲草素也是腺嘌呤的衍生物。另外,這三種化合物均有作為真菌發酵(主要是擔子菌)效應物的報道。

本文將不同濃度的三種植物生長調節劑三十烷醇(TRIA)、赤霉素(GA)和6-芐基腺嘌呤(6-BA)加入到蛹蟲草液體表面培養培養基中,探究植物生長調節劑對蛹蟲草菌絲生長和蟲草素積累的影響規律,并通過中心復合實驗設計(CCD)和響應面方法優化植物生長調節劑添加組合,以期提高蟲草素的生產效率,為蛹蟲草發酵生產的規模化、工廠化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種和材料

蛹蟲草(CordycepsmilitarisCICC 14014) 中國工業微生物保藏中心;斜面培養基:馬鈴薯汁200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB1微量;發酵培養基:葡萄糖42 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏6 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、腺嘌呤 4.0 g/L、花生油 4%(V/V),用5 mol/L HCl調節pH至5.80;TRIA 上海麥克林生化科技有限公司;GA和6-BA 阿拉丁試劑(上海)有限公司;蟲草素標準品購自中檢所。

LDZX-75KBS立式全自動滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;GNP-9080隔水式恒溫培養箱 上海三發科學儀器有限公司;SW-CJ-1BU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;PHS-3E酸度計 上海精科雷磁儀器廠;LC-20AD高效液相色譜儀(SPD-20A紫外檢測器) 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 蛹蟲草在斜面培養基上25 ℃恒溫培養7～10 d后,用無菌水將孢子刮下,經玻璃珠振蕩30 min后,用4層無菌紗布過濾,收集孢子懸液,利用血球計數板測定孢子濃度[15],并將孢子懸液濃度稀釋到1.0×103個/mL。

1.2.2 蛹蟲草液體表面培養 以10%(V/V)的接種量將孢子懸液接入到含有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中,充分振蕩混勻。在27 ℃靜置培養28 d。每組實驗進行三次。

1.2.3 生物量和蟲草素含量檢測 取培養一定時間的發酵液,10000 r/min離心10 min。上清液經適當稀釋后利用高效液相色譜法檢測蟲草素濃度。色譜條件:色譜柱為Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為無水甲醇∶10 mmol/L KH2PO4溶液=15∶85,柱溫40 ℃,流速1 mL/min,進樣量20 μL,檢測波長為260 nm。蟲草素濃度的HPLC標準曲線方程為Y=4.8×107X-129340(Y,峰面積;X,蟲草素濃度,g/L),相關系數R2為0.9997。蟲草素含量根據標準曲線方程采用外標法計算。蟲草素產量根據以下公式計算:

式中:P為蟲草素產量,g/L;c為蟲草素含量,g/L;V為三角瓶中收集的發酵液體積,mL;V0為三角瓶中初始加入的培養基體積,mL。

離心得到的沉淀用水洗滌3遍,110 ℃烘干至恒重,計算生物量。

菌體比生長速率按以下公式計算:

式中:μ為菌體的比生長速率,d-1;X為菌體生物量,g/L;t為培養時間,d。

1.2.4 植物生長調節劑的單因素實驗 在發酵培養基中分別添加不同濃度的各種植物生長調節劑(表1),進行液體表面培養28 d,測定蟲草素產量和生物量。

表1 各種植物生長調節劑的加入終濃度

1.2.5 植物生長調節劑的中心復合設計 以蟲草素產量為評價指標,采用3因素中心復合設計優化蛹蟲草液體表面培養中的植物生長調節劑組合,將單因素實驗的最優結果作為中心復合設計的中心點,中心實驗點設為6次,因素水平見表2。

表2 植物生長調節劑中心復合設計實驗因素編碼水平表

1.2.6 數據處理 用Design-Expert v8.0.6對實驗進行設計與數據回歸分析。利用方差分析評估實驗數據的顯著性。3D圖顯示變量間相互作用對蟲草素產量的影響。模型的準確性利用R2來評價。擬合方程的統計顯著性由方差分析中的F檢驗來評價。

2 結果與分析

2.1 TRIA濃度對蛹蟲草菌體生長和蟲草素積累的影響

由圖1可知,發酵初始的0～8 d菌體生長緩慢,為蛹蟲草菌體生長的適應期。孢子進入發酵培養基中需要適應新的生長環境,因此該階段菌體合成相應的酶類為快速生長做準備。TRIA的加入對蛹蟲草生長的適應期沒有顯著影響。發酵8 d后,菌體快速生長,進入快速生長期。發酵12 d,對照組的菌體最大比生長速率為0.376 d-1,0.2 mg/L TRIA的加入使菌體最大，生長速率達到0.459 d-1(8 d),比對照組提高了22.1%。發酵至28 d時,培養基中加入0.2 mg/L TRIA的菌體生物量達到37.56 g/L,比對照組高出130%。隨著TRIA濃度的增加,菌體生物量逐漸下降。因此,為了促進蛹蟲草菌體的生長,TRIA的最佳加入量為0.2 mg/L。TRIA活性的作用部位可能在細胞膜上[16],適當濃度的TRIA能夠增加細胞膜的透性,促進氮源和碳源的吸收、轉化,加快菌絲生長。但是濃度過高時,細胞膜透性減弱,營養吸收受到阻礙,會抑制菌體的萌發[16]。

圖1 TRIA對蛹蟲草菌體生長的影響

由圖2可知,隨著發酵培養基中TRIA加入量的增加,蟲草素產量也逐漸增加。當TRIA加入量為0.6 mg/L時,其促進蟲草素合成的效果最佳,培養28 d蟲草素產量達到5.24 g/L,比對照組提高了173%。當TRIA加入量繼續增大時,蟲草素產量又逐漸下降。TRIA能激活菌體內的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶[16],該酶是蟲草素前體的合成途徑(包括磷酸戊糖途徑及核苷酸合成途徑)的關鍵酶,因此適當濃度的TRIA能夠促進蟲草素的合成。

圖2 TRIA對蛹蟲草蟲草素積累的影響

2.2 GA濃度對蛹蟲草菌體生長和蟲草素積累的影響

由圖3可知,對照組菌體的適應期為8 d,而GA加入條件下,菌體適應期僅為4 d。這說明GA的加入縮短了蛹蟲草孢子萌發的適應期。同時,GA的加入可以明顯促進菌體生長。這可能是由于GA對細胞伸長和細胞分裂具有促進作用[17]。發酵至8 d,對照組的菌體比生長速率達到最大(0.367 d-1),而10 mg/L GA的加入將菌體比生長速率提高到0.634 d-1(4 d)。當發酵培養基中加入10 mg/L GA時,菌體生長最旺盛,發酵至28 d,生物量累積達到40.66 g/L。但是隨著GA濃度的繼續增加,蛹蟲草的生物質積累逐漸下降,即GA的促生作用僅在低濃度時最顯著。

圖3 GA對蛹蟲草菌體生長的影響

由圖4可知,除了促生作用之外,GA也能促進蟲草素的合成。當GA濃度為0～20 mg/L時,隨著GA濃度的增大,蟲草素產量呈上升趨勢;當GA濃度超過20 mg/L時,隨著GA濃度的增加,蟲草素產量呈下降趨勢。即20 mg/L GA對蛹蟲草表面液體發酵合成蟲草素的促進作用最明顯。發酵至28 d,蟲草素的產量達到3.16 g/L,比對照組提高了65%。

圖4 GA對蛹蟲草蟲草素積累的影響

2.3 6-BA濃度對蛹蟲草菌體生長和蟲草素積累的影響

圖5顯示的是不同濃度的6-BA對表面液體發酵條件下蛹蟲草菌體生長的影響。由圖5可知,6-BA同GA一樣,都有縮短蛹蟲草孢子萌發適應期的作用。這可能是由于在擔子菌生長過程中,6-BA促進了菌體中核酸和蛋白的合成代謝[18-19],從而促進孢子的生長發育。在一定濃度范圍內,6-BA能夠促進菌體生長。當發酵培養基中含有1.6 mg/L 6-BA時,其促生作用最為顯著。發酵28 d,蛹蟲草生物量達到27.32 g/L。

圖5 6-BA對蛹蟲草菌體生長的影響

另外,由圖6可知,6-BA也能夠促進蟲草素的積累。當發酵培養基中含有0～1.6 mg/L 6-BA時,隨著6-BA加入量的增加,蟲草素的積累也逐漸增加。當6-BA的濃度增加到2.0 mg/L時,蟲草素產量反而有所下降。因此,為了提高蟲草素的產量,單獨添加6-BA時,6-BA的最佳濃度為1.6 mg/L。此時,發酵28 d的蟲草素積累達到4.36 g/L,比對照組高出127%。

圖6 6-BA對蛹蟲草蟲草素積累的影響

2.4 中心復合實驗

菌體生長是蟲草素積累的前提，但菌體生長又與蟲草素合成競爭性利用碳源和氮源。從上述單因素實驗發現植物生長調節劑導致的菌體生長改變和蟲草素積累變化，兩者關系是復雜的。由單因素實驗可知,分別單獨加入TRIA、GA、6-BA時,加入量為0.60、20.00和1.60 mg/L時,均能獲得較高的蟲草素產量。因此,以此組合作為中心復合設計的中心點,利用Design-Expert v8.0.6軟件設計中心復合響應面實驗。實驗設計及結果見表3。

表3 中心復合實驗設計及結果

以蟲草素產量為響應值,運用Design-Expert v8.0.6軟件對表3中的實驗結果進行二次回歸分析,得到方程為Y=7.21-0.25A+0.40B+0.29C-0.13AB-0.52AC-0.035BC-0.89A2-0.79B2-0.85C2。回歸方程的方差分析及模型擬合度見表4。

表4 回歸方程的方差分析

由圖7及軟件分析可知,回歸方程存在最高點,通過對回歸方程求導及極值分析可知,TRIA為0.55 mg/L,GA為22.64 mg/L,6-BA為1.69 mg/L,此條件下預測得到的蟲草素產量為7.32 g/L。另外,通過方差分析(表4)和響應面(圖7)的結果分析,TRIA一方面增加細胞膜透性,促進了營養物質進入細胞,另一方面激活葡萄糖-6-磷酸脫氫酶促進五碳糖和嘌呤核苷酸的合成[16],而GA或6-BA則加速同化作用,強化了細胞的分裂,增加蟲草素合成的單元[17-19]。因此,GA與6-BA和TRIA均存在互補效應,在蟲草素合成上TRIA能夠與GA或6-BA產生協同促進作用。但是,GA與6-BA作用靶點重復,交互作用不明顯。

圖7 三十烷醇濃度、赤霉素濃度與6-芐基腺嘌呤濃度對蟲草素產量的響應面圖

2.5 驗證實驗

為檢驗響應面方法回歸方程預測結果是否可靠,采用上述最佳條件進行液體表面培養。最終,蟲草素產量達到7.31±0.19 g/L(n=5)。與方程預測值相比,相對誤差在1%以內。這表明響應面法擬合的回歸方程可以用于預測實際的蟲草素產量。

3 結論

本文利用三種植物生長調節劑TRIA、GA和6-BA對蛹蟲草液體表面培養過程的菌體生長、蟲草素合成進行調控,并結合多因素響應面實驗研究了植物生長調節劑的組合對蛹蟲草蟲草素積累的影響規律。三種植物生長調節劑TRIA、GA和6-BA均能不同程度的促進蛹蟲草的生長,但不同濃度的生長調節劑促進效果不同。經中心復合實驗設計和響應面實驗,三種植物生長調節劑的最佳組合為0.55 mg/L TRIA、22.64 mg/L GA與1.69 mg/L 6-BA,在該條件下蟲草素最大產量達到7.31 g/L接近預測值，可用于預測實際蟲草素產量。

[1]文庭池,雷幫星,康冀川,等. 添加前體促進蛹蟲草發酵生產菌絲體和蟲草菌素的研究[J]. 食品與發酵工業,2009,35(8):49-53.

[2]Cui J D. Biotechnological production and applications ofCordycepsmilitaris,a valued traditional Chinese medicine[J]. Crit Rev Biotechnol,2015,35(4):475-484.

[3]Fan D D,Wang W,Zhong J J. Enhancement of cordycepin production in submerged cultures ofCordycepsmilitarisby addition of ferrous sulfate[J]. Biochem Eng J,2012,60(1):30-35.

[4]秦鵬,王龍,趙玉卉,等. 響應面法優化蛹蟲草菌絲液體發酵產蟲草素培養基[J]. 食品工業科技,2016,37(8):185-190.

[5]Masuda M,Das S K,Hatashita M,et al. Efficient production of cordycepin by theCordycepsmilitarismutant G81-3 for practical use[J]. Process Biochem,2014,49(2):181-187.

[6]Masuda M,Das S K,Fujihara S,et al. Production of cordycepin by a repeated batch culture of aCordycepsmilitarismutant obtained by proton beam irradiation[J]. J Biosci Bioeng,2011,111(1):55-60.

[7]Das S K,Masuda M,Sakurai A,et al. Effects of additives on cordycepin production using aCordycepsmilitarismutant induced by ion beam irradiation[J]. Afr J Biotechnol,2009,8(13):3041-3047.

[8]Das S K,Masuda M,Hatashita M,et al. Optimization of culture medium for cordycepin production usingCordycepsmilitarismutant obtained by ion beam irradiation[J]. Process Biochem,2010,45(1):129-132.

[9]湯佳鵬,柳依婷. 蛹蟲草靜置發酵產蟲草素的優化[J]. 食品工業科技,2013,34(20):225-229,245.

[10]Zhang Q,Liu Y,Di Z B,et al. The strategies for increasing cordycepin production ofCordycepsmilitarisby liquid fermentation[J]. Fungal Genomics & Biology,2016,6(1):1000134.

[11]阮元,馬進川,薛元,等. 維生素B1、B6和生長激素2,4-D對蛹蟲草液體發酵蟲草素產量的影響[J]. 菌物學報,2014,33(2):477-482.

[12]汪宇,于榮敏,佟志清,等. 蛹蟲草液體培養條件的優化及生長動力學考察[J]. 中國野生植物資源,2003,22(4):56-60.

[13]張慧鋒. 北冬蟲夏草子實體培養條件的探索[J]. 吉林醫藥學院學報,2005,26(4):192-194.

[14]歐陽召,王春梅,陶志. 適合蟲草素積累的蛹蟲草液體培養條件的優化[J]. 中國食用菌,2012,31(01):26-28.

[15]尚曉東,李明容,王南,等. 應用血球計數板檢測靈芝破壁孢子粉破壁率的研究[J]. 食用菌學報,2005,12(2):37-40.

[16]劉華,韓文儒,徐曉華. 三十烷醇對慶大霉素產生菌生長代謝影響的研究[J]. 微生物學通報,1996,23(4):222-223,216.

[17]胡現龍. 植物激素對黑曲霉生長的影響和黑曲霉的固定化[D]:青島:中國海洋大學,2008.

[18]徐平. 6-芐基腺嘌呤對雙孢蘑菇菌絲體生長及生理生化特性的影響研究[J]. 食用菌,2004,26(6):12-13.

[19]邱昌恩,江涓. 6-芐基腺嘌呤促進香菇菌絲體生長的作用機理研究[J]. 食用菌,2002,24(5):4-5.