冷鮮豬肉中生物膜形成細菌鑒定及成膜變形桿菌清除

朱 晨,李曼寧,王 蕊,劉變芳,宋巧智,夏效東

(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

伴隨著生產和貿易的快速發展,冷鮮豬肉產品消費量不斷增加。冷鮮豬肉營養豐富、水分含量高,在生產流通過程中極易受微生物污染,其生產過程來自動物腸道、皮毛和環境中的腐敗菌和致病性細菌極易在不銹鋼、玻璃和塑料等器具設備表面形成難以清除的細菌生物膜引起產品交叉污染和食源性疾病爆發[1-4]。細菌生物膜可由一種或者多種微生物形成,水分含量高達97%,穩定粘附于物體表面后,細菌開始大量增殖,分泌多種粘附因子,形成致密的生物聚集體[5-6]。相比單個的浮游菌,存在于生物膜中的細菌,由于各種粘附因子的保護,菌體對環境的適應性更強,更不易被清除[7-8]。Bonsaglia等[9]研究了多株李斯特菌在不同材料表面的成膜情況,發現不銹鋼片表面粘附的菌株明顯多于玻璃片。影響微生物形成生物膜的因素包括微生物自身的性質、載體表面性質和培養條件等[10-11]。

清洗是提高食品加工設備衛生的重要手段,清洗劑通常是表面活性劑或堿產品,能夠清除接觸表面90%以上的微生物[12]。但是,由于生物膜結構賦予細菌更強的耐受性,因此,很難完全殺死生物膜中的細菌[13]。消毒是通過破壞或溶解胞外聚合物,使抑制劑能夠直接作用于細菌[14]。目前認為游離氯、二氧化氯、臭氧和過氧化氫是合適的消毒劑[15]。柴海榮等[16]發現堿性清洗劑可以減弱生物膜與器械表面黏附力,相比于含酶清洗劑,其清除效果更好。

本文以冷鮮豬肉淋洗液為培養基質,探究不同材質、溫度及培養時間下的生物膜形成情況,并采用16S rRNA鑒定具有生物膜形成能力的細菌種類,研究NaClO清洗劑和超聲波模擬冷鮮豬肉工業生產條件下生物膜的清除情況，為預防和控制冷鮮肉生產過程細菌生物膜污染提供了理論依據和指導,對保證冷鮮肉品質及衛生安全具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮豬肉 陜西省楊凌示范區超市當日采集備用;均質袋(32 cm×20 cm) 青島高科技工業園海博生物技術有限公司;304型號不銹鋼片(20 mm×11.5 mm×0.5 mm) 上海市浩程旗艦店;玻璃試管(15 mm×100 mm) 楊凌新三力化玻站;堿性清洗劑 上海雪豹日用化學有限公司;LB 瓊脂、LB 肉湯、氯化鈉、氯化鉀、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 北京陸橋技術有限責任公司;結晶紫、冰乙酸、無水乙醇 成都市科龍化工試劑廠;次氯酸鈉溶液(有效氯30 g/L) 朗力生物醫藥有限公司;2×EsTaqMasterMix、DNA Marker DL 2000 北京康為世紀生物科技有限公司;DuRed核酸染料 北京泛博生物化學有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

DPX-9082 B-2型恒溫培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司;VORTEX-6型漩渦振蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Smart SpecTMplus分光光度計、GelDoc 2000型凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司;9600型基因擴增儀 珠海黑馬醫學儀器有限公司;CD-UPTL II超純水制造系統 成都越純科技有限公司;5804R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;KQ5200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 不銹鋼片和玻璃試管處理:無水乙醇中浸泡30 min,蒸餾水沖洗3遍,70 ℃堿性洗衣粉中浸泡1 h,超聲波清洗15 min,蒸餾水浸泡沖洗3遍,60 ℃烘干,121 ℃下高壓滅菌25 min,60 ℃烘干備用。

冷鮮豬肉濾液制備:冷鮮豬肉絞碎,稱取15 g放入無菌均質袋中,加入0.85%無菌生理鹽水285 mL,拍打振蕩10 min,八層無菌紗布過濾,保留濾液。

1.2.2 冷鮮肉中細菌成膜特性研究 肉湯中細菌總數按照GB4789.2-2010《食品衛生微生物學菌落總數測定》進行檢測,確定采集樣品細菌總數未超標[17]。參考Carter等[18]的方法,采用試管內置不銹鋼片法培養肉湯中菌群生物膜。試管中加入 2 mL肉湯濾液,放置不銹鋼片,塞上硅膠塞,放置在4、15和26 ℃下靜置培養,每個溫度做5個試管重復。其中4 ℃為通常冷藏溫度，15 ℃為工廠通常作業溫度，26 ℃為本實驗室室溫。分別培養1、3、6、10、14 d后,取出鋼片,棄濾液,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。鋼片原位放回試管,加入2 mL 0.1% 結晶紫室溫染色30 min。再次取出鋼片放入干凈離心管,棄染液,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入2 mL 33%冰乙酸對試管和不銹鋼片脫色20 min,20 ℃下40 kHz超聲10 min,漩渦振蕩2 min。吸取160 μL脫色液體加入96微孔板中,酶標儀測定OD570值。

1.2.3 成膜細菌分離鑒定 在1.2.2結果基礎之上，將冷鮮豬肉濾液于26 ℃下靜置培養3 d至混合細菌生物膜成熟后,取出鋼片,棄去肉湯,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入 2 mL PBS溶液,20 ℃下40 kHz超聲10 min,漩渦振蕩2 min,至生物膜完全洗脫。10倍系列梯度稀釋后,取2～3個合適稀釋度涂布LB瓊脂平板,37 ℃培養18～24 h。挑選優勢典型單菌落特征的單菌落劃線轉接新平板進行分離純化。

挑取純化的單菌落加入裝有15 μL無菌水的1.5 mL離心管中,漩渦振蕩混勻,100 ℃煮沸20 min使細胞熱裂解。10000 r/min,4 ℃離心1 min,取上清備用。采用細菌通用引物,上游引物(27F):5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物(1492R):5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,擴增產物片段長度約為1 500 bp[19]。25 μL PCR反應體系:細菌模板1 μL,12.5 μL 2×Taq Master Mix,上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL),9.5 μL無菌ddH2O。PCR擴增程序:94 ℃變性2 min,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,共32個循環,72 ℃延伸10 min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送到生工生物有限公司測序,通過NCBI序列比對鑒定細菌。

1.2.4 細菌生物膜的清除 參考宋金武等[20]和Taj等[21]的方法,用不同濃度次氯酸鈉、超聲波對細菌生物膜進行清除研究。平板活菌計數和結晶紫染色測定生物膜清除效果,掃描電子顯微鏡檢測驗證。

菌懸液的制備:冷鮮豬肉中分離到一株的成膜能力強且穩定的條件致病性普通變形桿菌(proteusbacillusvulgaris),生物膜清除實驗以此為實驗菌株。挑取單菌落轉接于20 mL LB液體培養基中,37 ℃振蕩培養24 h。離心(8000 r/min,4 ℃)5 min,棄上清液,新鮮LB肉湯重懸洗滌2次。調節OD600至0.5左右(約108CFU/mL),20倍稀釋后進行生物膜培養(即接種量為5%)。

細菌生物膜的形成及清除:試管中加入2 mL接種量為5%的LB肉湯,放置不銹鋼片(玻片),26 ℃生化培養箱中靜置培養48 h。取出鋼片(玻片),無菌水浸洗試管和鋼片(玻片)3遍,晾干。并按照以下清除方法進行,CK:2 mL PBS溶液,浸泡5 min;A:200 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min;B:400 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min;C:600 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min;D:400 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min,100 kHz超聲1 min;E:2 mL PBS溶液,浸泡5 min,100 kHz超聲1 min。每種處理6組平行。

1.2.5 細菌生物膜清除效果檢測 平板活菌計數法:取出鋼片,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入2 mL PBS溶液(pH7.4),20 ℃下40 kHz超聲10 min,漩渦振蕩1 min,至生物膜完全洗脫。10倍系列梯度稀釋后,取2～3個合適稀釋梯度于LB瓊脂培養基上涂布,37 ℃培養24 h后進行平板計數。每個稀釋度涂布3個平板。

將菌落數進行換算,即可作為定量生物膜的指標,換算式如(1):

式(1)

式中:A為樣液中菌落數,CFU/mL;B為樣液體積,2 mL;C為生物膜附著的表面積,cm2。

清除效果按照式(2)進行計算:

式(2)

式中:D為對照組細菌總數,CFU/cm2;E為不同清除處理后的細菌總數,CFU/cm2。

結晶紫染色法:取出鋼片,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入2 mL 0.1% 結晶紫室溫下染色30 min,無菌水浸洗3遍,晾干。33%冰乙酸脫色,冰浴超聲10 min,漩渦振蕩1 min,至生物膜完全溶解。吸取200 μL洗脫液加入96微孔板中,酶標儀測定其OD570值。

掃描電子顯微鏡觀察生物膜:取出玻片,無菌水浸洗3遍,晾干,置于 2.5%戊二醛溶液中,4 ℃下固定10 h,分別用 PBS溶液和無菌水浸洗3次,每次10 min。1% 鋨酸溶液室溫25 ℃下固定5 h,無菌水浸洗3遍,晾干。10%,30%,50%,70%,90%和100%乙醇梯度洗脫玻片各10 min,其中100%乙醇洗脫2次。乙酸異戊酯置換10 min。玻片置于二氧化碳臨界點干燥儀中進行冷凍干燥,用導電銀膠固定在掃描電鏡的樣品臺上噴金鍍膜,達到真空度后,觀察細菌生物膜形態結構并拍照。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 冷鮮豬肉中細菌成膜特性

細菌總數檢測到肉湯濾液中的細菌總數為5.39 lg(CFU/mL)。不同溫度下,不銹鋼和玻璃兩種材質上冷鮮豬肉中的細菌生物膜形成均呈先升后降趨勢,并隨溫度升高,細菌生物膜的成熟期縮短,且在同溫下兩種材質上細菌生物膜形成同時達到頂峰。4、15和26 ℃下,兩種材質上的細菌生物膜分別在第10、6和3 d達到峰值。并且,整體不銹鋼材質上細菌生物膜量高于玻璃材質(見圖1)。

圖1 不同溫度下冷鮮豬肉中菌群在玻璃和不銹鋼表面生物膜形成

2.2 成膜細菌的分離鑒定

洗脫玻璃和不銹鋼片上的細菌生物膜,制備懸液,涂布LB瓊脂培養基進行分離純化。純化菌株采用細菌通用引物進行16S rRNA鑒定。PCR擴增條帶1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。觀察到單一條帶與預測的條帶片段大小(1500 bp)一致,說明從冷鮮豬肉中分離純化出的1～9號分離菌株提取的DNA片段完整性較好,可以進行測序。

圖2 分離菌株16S rRNA序列擴增結果

如表1所示,對9株優勢菌株的擴增條帶進行測序、比對鑒定,具有生物膜形成能力的9株細菌中有1株假單胞菌,1株成團泛菌,2株普通變形桿菌,5株腐敗希瓦氏菌,其中腐敗希瓦氏菌占55.6%和普通變形桿菌占22.2%，為冷鮮肉中主要成膜污染菌。腐敗希瓦氏菌適合低溫生長,是富含蛋白食品的典型腐敗菌,目前在魚類低溫貯藏過程中多有發現和研究[22-23]。而普通變形桿菌是條件致病菌,一般存在于被污染或者變質的食物中,且具有較強的生物膜形成能力[24]。

表1 成膜菌株16S rRNA序列比對結果

2.3 細菌生物膜清除效果

平板計數和結晶紫檢測均表明,200～600 mg/L NaClO溶液和100 kHz超聲清洗對玻璃及不銹鋼片表面形成的生物膜均有顯著的清除效果(p<0.05)。同一處理對玻璃和不銹鋼兩種材質的清除效果無顯著差異(p>0.05)。

200～600 mg/L NaClO溶液對玻璃和不銹鋼表面變形桿菌生物膜的清除率分別可達99%和98%。100 kHz超聲1 min后玻璃和不銹鋼表面的清除率分別是51.02%和71.82%,即不銹鋼表面變形桿菌生物膜清除效果是玻璃表面的1.4倍。400 mg/L NaClO溶液結合100 kHz超聲聯合處理后,生物膜細菌清除率略優于400 mg/L NaClO溶液單獨清除的效果(見表2和圖3)。NaClO溶液濃度、作用時間以及針對不同的細菌,都會影響生物膜的清除效率。Sarjit等[25]采用40、50 和60 mg/L NaClO溶液對沙門氏菌生物膜作用10 min發現對沙門氏菌殺菌效果很差。Kim等[26]研究發現200 mg/L NaClO溶液和1800 mWs/cm2紫外協同作用可以有效清除工業廚房和餐廳不銹鋼表面上的李斯特菌生物膜。

表2 不同清除方法對玻璃和不銹鋼表面變形桿菌生物膜清除效果

圖3 結晶紫染色測定不同材質上變形桿菌生物膜的清除結果

2.4 掃描電鏡檢測玻璃表面生物膜清除效果

由圖4可知,對照組中,桿狀菌體緊密的粘附在玻片表面,相互堆疊,結構緊密,互相連結,顯示了菌株良好的生物膜形成能力。菌體在經過不同濃度NaClO溶液清洗后,粘附在玻片上的生物膜大部分都已脫落,僅剩下零星細菌分布在蓋玻片表面,菌體之間極其松散。400 mg/L NaClO溶液結合100 kHz超聲聯合處理后僅觀察到少數單個菌體,變形桿菌生物膜幾乎被完全清除。100 kHz超聲1 min后仍可觀察到大量菌體,且菌體之間相互連接、堆疊,但是生物膜的結構相對松散。

圖4 掃描電鏡觀察玻片上生物膜的清除結果(5000×)

3 結論

冷鮮豬肉中污染的微生物極易在玻璃及不銹鋼材質表面形成細菌生物膜,其中,在不銹鋼表面形成的生物膜量大于玻璃材質,并隨著溫度升高,生物膜形成量達到峰值時間提前。從冷鮮豬肉中共分離鑒定到9株主要成膜細菌,包括普通變形桿菌、腐敗希瓦氏菌和假單胞菌等,其中腐敗希瓦氏菌和普通變形桿菌分別占成膜分離菌總數的55.6%和22.2%。

NaClO溶液和100 kHz超聲波清洗可以有效地清除玻璃和不銹鋼材質表面的變形桿菌生物膜,200～600 mg/L的NaClO溶液對玻璃和不銹鋼表面變形桿菌生物膜的清除率分別可達99%和98%以上。100 kHz超聲1 min后不銹鋼表面變形桿菌生物膜清除效果是玻璃表面的1.4倍。400 mg/L NaClO溶液與100 kHz超聲聯合處理對兩種材質表面變形桿菌生物膜清除率略優于400 mg/L NaClO溶液單獨清除的效果。

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