脈沖強光誘變保加利亞乳桿菌高產胞外多糖

陶雨施,張佰清

(沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是微生物在成長代謝過程中分泌到細胞外的呈黏狀或夾膜狀的糖類化合物[1]。乳酸菌是食品級細菌,乳酸菌胞外多糖具有獨特的物理學和生物學特性,可以作為乳化劑、膠凝劑、穩定劑應用于食品加工領域。同時因其具有獨特的抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降膽固醇、提高免疫力等生物學特性逐漸受到人們的重視[2]。然而乳酸菌胞外多糖產量較低,使其在食品加工中大量使用受到限制。目前,利用誘變技術選育高產、高活力且穩定遺傳的改良菌株已成為研究熱點。常用于提高乳酸菌高產胞外多糖的誘變方法有硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變、亞硝酸鈉誘變及紫外光照射等,但這些誘變方法對提高菌株多糖產量的作用普遍不大,且化學誘變劑的高毒性會對操作者及生態環境造成一定威脅[3-4]。

脈沖強光(Intense pulse light,IPL)是一種新型冷處理技術,具有環保、安全、快捷的特點,可以有效殺死致病菌和腐敗菌,且與連續紫外線相比,脈沖光操作更簡單、照射時間更短、穿透能力更強[5]。Cheigh等[6]研究發現,脈沖強光會通過產生順式環丁烷嘧啶二聚體和嘧啶(6-4)嘧啶酮光產物((6-4)PPs)使微生物DNA出現雙鍵斷裂、缺失等損傷,并且當這種DNA損傷未被及時修復就會導致細胞發生誘變。目前,脈沖強光正逐漸應用于優良菌株的誘變選育。孟憲軍等[7]用脈沖強光對納塔爾鏈霉素進行誘變,選育出突變株SN114,使那他霉素產量較原始株提高了1.6倍。趙春燕等[8]通過脈沖強光誘變得到Nisin高產突變株。張佰清等[9]通過脈沖強光誘變得到多抗性啤酒酵母。

本實驗以產糖菌株保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)IMAU40160為研究對象,利用脈沖強光對其進行誘變處理以提高胞外多糖產量,并對突變株多糖的簡單結構和抗氧化活性進行分析,最后對脈沖強光誘變機理進行初探。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.bulgaricusIMAU40160 沈陽農業大學食品科學與工程實驗室;苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚 均為分析純,國藥集團化學試劑公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍、丙烯酰胺、過硫酸銨 北京鼎國試劑公司;脫脂乳粉 完達山乳業股份有限公司;MRS液體和固體培養基、脫脂乳培養基 參照馮美琴等[10]的方法配制;蛋白裂解液 參照徐宗凱等[11]的方法配制。

脈沖強光裝置 波長范圍在200～1100 nm,其中紫外光部分占15%～20%,脈沖寬度20 μs,最大輸入能量644 J[12],由沈陽農業大學食品學院自制;高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申器械有限公司;超凈工作臺 上海博訊有限公司;恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;NDJ-5S粘度計 上海精科天美科學儀器有限公司;離心機 Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1L.bulgaricus生長曲線的測定 將凍存菌L.bulgaricusIMAU40160以接種量4%接種于MRS液體培養基中,37 ℃恒溫培養12 h,傳代活化3次。活化后的L.bulgaricusIMAU4016以3%的接種量接種于MRS液體培養基中,37 ℃靜置培養,每隔2 h取出,紫外分光光度計測定OD600的吸光值。以時間為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制菌株生長曲線。

1.2.2 脈沖強光誘變處理 用滅菌生理鹽水將生長至對數期的L.bulgaricusIMAU40160菌體洗滌兩次,并將菌體重新懸浮于生理鹽水中,制成細胞濃度為105個/mL的菌懸液。將10 mL菌懸液轉移到直徑為9 cm的滅菌培養皿中,放入脈沖強光處理室,確保培養皿位于氙燈的正下方,在脈沖電壓1800 V,脈沖距離9 cm的條件下,采用脈沖強光分別照射處理4、7、10、13、16、19次。照射處理后,取100 μL菌懸液涂布于MRS固體培養基上,37 ℃避光培養48 h后,根據下列公式計算各照射處理次數下菌株的致死率和正突變率。

式中:N0-誘變處理前活菌數;N1-誘變處理后活菌數。

式中:S-正突變菌落數(突變株EPS產量提高10%視為正突變);U-篩選菌落數。

1.2.3 高產胞外多糖突變株的篩選

1.2.3.1 初篩 以發酵乳粘度作為初篩高產胞外多糖突變株的依據。挑取培養基上的單菌落進行活化,活化后以6%的接種量(濃度108個/mL)分別接種于滅菌脫脂乳中,37 ℃發酵12 h至凝乳。4 ℃下冷藏24 h,粘度計測定發酵乳粘度,初篩出產粘能力較強的菌株。

1.2.3.2 復篩 將初篩得到菌株活化后,以6%的接種量接種于MRS液體培養基中,37 ℃條件下培養24 h制得發酵液,通過測定發酵液中多糖含量,篩選出胞外多糖高產突變株。

1.2.3.3 多糖含量的測定及產量的計算 取30 mL發酵液,加入6 mL的sevag試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)混合均勻,4 ℃靜置過夜后,9500 r/min離心20 min,取上清液,蒸餾水透析36 h,每8 h換1次水,得到多糖溶液。參照羅佳等[13]的方法繪制得到葡萄糖標準曲線方程為:y=13.631x-0.0136(R2=0.998),式中x為多糖濃度;y為OD490的吸光度。將多糖溶液稀釋10 倍,通過苯酚-硫酸法[14]測定多糖溶液在490 nm處的吸光度,帶入以下公式計算多糖含量。

式中:A-測定值OD490。

1.2.4 粗多糖的制備 取30 mL發酵液,加入6 mL的sevag試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1),9500 r/min離心10 min除去菌體和蛋白。將離心后的上清液裝入透析袋中蒸餾水透析36 h。透析液中加入3倍體積分數為95%的乙醇,4 ℃醇沉過夜,多糖呈絮狀沉淀析出,9500 r/min離心10 min,將所得沉淀冷凍干燥即得到粗多糖。

1.2.5 遺傳穩定性的測定 將突變株在固體培養基上連續傳6代,37 ℃恒溫培養24 h,取每一代進行發酵,檢測其胞外多糖產量的穩定性。

1.2.6 傅里葉紅外光譜分析 取1 mg粗多糖樣品與適量KBr混合,壓片制樣,使用紅外光譜儀在500～4000 cm-1的頻率范圍內進行掃描分析。

1.2.7 掃描電鏡分析 粗多糖樣品用雙面膠固定,噴金,高真空模式下進行掃描電子顯微鏡測定,工作電壓12.5 kV,放大倍數為1000。

1.2.8 抗氧化分析

式中:A0-蒸餾水代替樣品的吸光度;A1-多糖樣液和反應液的吸光度。

1.2.8.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測定 羥基自由基的測定參照Seedevi等[16]的方法。取 1 mL不同濃度的多糖溶液(0.2～1.0 mg/mL),依次加入2 mL(1.0 mmoL/mL)的FeSO4,1 mL(1.8 mmoL/mL)的水楊酸-乙醇溶液,0.1 mL的0.3%的H2O2溶液啟動反應。37 ℃水浴反應30 min,510 nm處測定吸光度。蒸餾水作為空白。每個濃度的樣品做三個平行,取平均值計算清除率。清除率采用以下公式進行計算:

式中:A0-蒸餾水代替樣品的吸光度;A1-多糖樣液和反應液的吸光度。

1.2.9 SDS-PAGE凝膠電泳分析 菌體蛋白的提取:取適量菌體發酵液,無菌水洗滌三次,9500 r/min 4 ℃離心10 min收集菌體沉淀。加入1000 μL裂解液進行超聲破碎,超聲條件為振4 s,停4 s,處理功率43%,超聲處理30 min后,12000 r/min離心30 min收集上清液,即蛋白溶液。

SDS-PAGE凝膠電泳:蛋白電泳操作方法參照文獻[17]。其中分離膠濃度為12%,濃縮膠為5%。濃縮膠處理電壓80 V,分離膠處理電壓90 V,電泳完成后依次對膠體進行固定,染色,脫色處理。

1.3 數據處理

實驗數據均平行測定三次,測定結果以平均值±標準差(SD)表示,使用SPSS 17.0軟件進行數據處理和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 L. bulgaricus IMAU40160的生長曲線

L.bulgaricusIMAU40160出發株生長曲線如圖1所示,0～2 h內菌株處于延遲生長期,2～10 h處于對數生長期,10 h后菌株生長進入穩定期。誘變處理一般選取對數生長中后期的菌株,此時的菌株對誘變劑更為敏感,容易發生變異且重復性更好[18]。因此實驗選取8 h的菌株進行誘變處理。

圖1 L. bulgaricus IMAU40160 出發株的生長曲線

2.2 脈沖強光誘變劑量的確定

在不同脈沖次數條件下對原始菌株進行誘變處理,考察菌株的正突變率與致死率。如圖2所示,脈沖處理10次時正突變率達到最大。這可能是由于脈沖光的光化學效應使菌體DNA發生雙鍵斷裂或缺失,影響了DNA的轉錄翻譯過程而使菌株發生突變[19]。隨著脈沖次數的繼續增加,菌株的致死率逐漸增強,在脈沖次數10 次時,致死率達到78.9%;脈沖次數19次時,菌株的致死率達到98.8%。這是由于脈沖光的光化學效應與脈沖次數呈正相關作用,當脈沖次數達到一定程度后,光化學效應所表現出的致死作用會使菌體大量死亡,且不利于正突變的形成[20]。在脈沖次數10次時,其致死率為78.9%,正突變率達到最大值16.7%,此條件更有利于篩選工作的進行和正突變株的形成。因此,選取10 次為最佳脈沖次數,并在此條件下對菌株進行誘變處理。

圖2 脈沖強光對L. bulgaricus致死率和正突變率的影響

2.3 EPS高產菌株的篩選

2.3.1 發酵乳粘度初篩 胞外多糖高產突變株的初篩結果如圖3所示,不同突變株的產粘能力不同。唐艷等[21]研究發現,乳酸菌的胞外多糖產量與其發酵乳粘度呈正相關關系。因此,實驗選取粘度較原始株顯著提高(p<0.05)的7株突變株進行復篩,即突變株L12、L13、L21、L23、L27、L31、L47。

圖3 脈沖強光誘變突變株的發酵乳粘度測定

2.3.2 復篩 脈沖強光對L.bulgaricusIMAU40160誘變的復篩結果如表1所示,突變株L27的胞外多糖產量高達(490.98±12.26) mg/L,較原始株(247.90±13.16) mg/L提高了98.05%,選取突變株L27進行后續實驗。

表1 復篩結果

2.4 遺傳穩定性的測定

將突變株L27在固體培養基上連續劃線培養6代,測定突變株每代產糖能力。結果如圖4所示,突變株L27具有較穩定的胞外多糖產糖能力,表現出較好的遺傳穩定性。

圖4 突變株L27遺傳穩定性的測定

2.5 紅外光譜分析

突變株L27和原始株胞外多糖的紅外光譜圖如圖5所示,兩種多糖樣品都在3283、2937、1654、1408、1133、620和521 cm-1附近出現了吸收峰。吸收峰在3323 cm-1處表明有O-H的振動吸收;2937 cm-1處代表著C-H 的伸縮振動;吸收峰在1654 cm-1和1560 cm-1處對應C=O鍵[22]。在1408 cm-1處的吸收峰是羧基或羧酸酯的典型特性吸收峰。1133 cm-1處的強吸收帶,表明多糖中含有吡喃糖環[23]。620 cm-1和521 cm-1處表明多糖的糖基基團之間由糖苷鍵連接。由圖可知,突變株L27胞外多糖的官能團相較于原始株沒有明顯差異,因此說明脈沖強光誘變處理不會影響菌株胞外多糖的主要化學鍵,此結果與Fang等[24]一致。

圖5 突變株L27和原始株多糖紅外光譜

2.6 掃描電鏡分析

突變株L27和原始株胞外多糖的掃描電鏡圖片如圖6所示,圖6A為原始株胞外多糖的掃描電鏡圖,原始株胞外多糖的微觀結構呈光滑發亮的蜂窩狀,Ahmed[25]研究發現這是形成塑化薄膜所需的基本特征。圖6B為突變株L27胞外多糖的表觀結構,呈現不規則多孔緊湊結構。研究表明,這種多孔結構會使多糖具有更高的保水能力,更易溶于水,從而使其快速膨脹,這是作為乳化劑、穩定劑和膠凝劑的重要條件[26]。由掃描電鏡結果可知,脈沖強光誘變處理改變了菌株胞外多糖的表面結構,且由微觀結構的對比發現脈沖強光突變株所產胞外多糖更適合作為天然質地調節添加劑應用于食品工業。

圖6 多糖掃描電鏡圖(1000×)

2.7 抗氧化活性的測定

圖7 超氧陰離子自由基清除能力的測定 radical scavenging activity

2.7.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測定 羥基自由基(·OH)是一種強效的氧化劑可以與活體細胞內的生物大分子發生反應,誘導鄰近大分子發生嚴重損傷[30]。L27和原始株胞外多糖對·OH自由基的清除能力如圖8所示。兩種多糖樣品對·OH自由基的清除能力隨著多糖濃度的增大呈上升趨勢。在多糖濃度在0.2～1.2 mg/mL之間時,L27胞外多糖的·OH清除能力顯著高于原始株(p<0.05)。突變株L27胞外多糖的EC50為0.74 mg/mL,而原始株胞外多糖的·OH自由基清除能力還未達到EC50。相較于原始株,L27胞外多糖表現出較高的·OH清除能力,這可能是由于突變株L27多糖可以結合更多由芬頓反應產生的游離羥基,而表現出較高的抗氧化活性[31]。同時,L27胞外多糖的·OH清除能力高于BacillustequilensisFR9[32],具有較好的清除能力。

圖8 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

由突變株L27和原始株胞外多糖抗氧化活性的測定結果可知,脈沖強光誘變在提高菌株胞外多糖產量的同時提高了多糖的抗氧化活性。脈沖強光誘變對菌株多糖抗氧化活性的提高具有更積極的作用。

2.8 SDS-PAGE電泳分析

通過SDS-PAGE凝膠電泳的方法對突變株L27和原始株的菌體蛋白進行差異分析,試圖通過觀察菌體蛋白的差異來探究脈沖強光的誘變機理。實驗結果如圖9所示。突變株L27和原始株的菌體蛋白都分布在15～225 kDa之間,突變株較原始株出現差異條帶。突變株L27較原始株多出約在83、76、42、17、12 kDa處的條帶,缺失約在65 kDa處的蛋白條帶。這是可能是由于脈沖強光誘變處理后,誘導了原始株的某些蛋白表達,從而可以篩選出胞外多糖高產突變株。

圖9 原始菌和突變株L27的SDS-PAGE分析

3 結論

本研究對產糖乳酸菌L.bulgaricusIMAU40160進行脈沖強光誘變處理,在致死率78.9%、正突變率16.7%的條件下,獲得高產突變株L27,其多糖產量(490.98±12.26) mg/L較原始株提高了98%。沖強光作為一種安全、環保、操作簡單的處理方式,其應用于L.bulgaricusIMAU40160高產胞外多糖的誘變選育,克服了傳統誘變方式(高毒性、操作繁瑣)的弊端,為工程菌株的誘變選育提供了新的思路和技術手段。本研究首次對誘變前后菌株所產多糖的簡單結構和抗氧化活性進行對比分析,發現脈沖強光處理未對突變株多糖的結構造成不良影響,相反提高了多糖的抗氧化活性。同時,從蛋白水平上對脈沖強光誘變機理進行了初探,發現脈沖強光引發了菌株蛋白表達的差異。綜上,本研究為脈沖強光應用于優良菌株的誘變選育提供了技術參數和理論基礎。

[1]Donot F,Fontana A,Baccou J C,et al. Microbial exopolysaccharides:Main examples of synthesis,excretion,genetics and extraction[J]. Carbohydrate Polymers,2012,87(2):951-962.

[2]Ruas-Madiedo P,Salazar N,Reyes-Gavilán C G D L. Chapter 45-Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria in food and probiotic applications[J]. Microbial Glycobiology,2010,885(2):887-902.

[3]Breuer U,Babel W. Methylobacterium rhodesianum produces poly-3-hydroxybutyrate and after mutagenesis in addition exopolysaccharides[J]. Acta Biotechnologica,2010,19(1):79-86.

[4]Liu Q,Huang X,Yang D,et al. Yield improvement of exopolysaccharides by screening of theLactobacillusacidophilus ATCC and optimization of the fermentation and extraction conditions[J]. Excli Journal,2016,15:119-122.

[5]Garvey M,Rowan N. A pulsed light system for the disinfection of flow through water in the presence of inorganic contaminants[J]. Journal of Water and Health,2015,13(2):406-411.

[6]Cheigh C I,Park M H,Chung M S,et al. Comparison of intense pulsed light-and ultraviolet(UVC)-induced cell damage in Listeria monocytogenes,andEscherichiacoliO157∶H7[J]. Food Control,2012,25(2):654-659.

[7]孟憲軍,鄭鳳娥,張琦. 納塔爾鏈霉菌的脈沖強光誘變育種研究[J]. 食品工業科技,2008,29(3):141-142.

[8]趙春燕,孟曉曦,劉長江. 脈沖強光誘變選育Nisin高產菌株[J]. 食品科技,2010(8):32-34.

[9]張佰清,孫欄夢. 脈沖強光對啤酒酵母的誘變效應[J]. 食品科學,2015,36(7):153-157.

[10]馮美琴. 植物乳桿菌胞外多糖發酵、結構鑒定及其功能特性研究[D]. 南京:南京農業大學,2012.

[11]徐宗凱,林青青,周夢瑩,等. 三種李斯特菌菌體蛋白提取方法的比較[J]. 生命科學研究,2015,19(1):29-33.

[12]馬鳳鳴,張佰清,徐江寧,等. 脈沖強光殺菌裝置設計的初步研究[J]. 食品與機械,2005,21(6):66-67.

[13]羅佳,嚴敏嘉,李小芳,等. 固態發酵紅曲中多糖含量測定方法的比較研究[J]. 食品研究與開發,2017,38(3):130-133.

[14]Masuko T,Minami A,Iwasaki N,et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format[J]. Analytical Biochemistry,2005,339(1):69-72.

[15]Arun J,Selvakumar S,Sathishkumar R,et al.Invitroantioxidant activities of an exopolysaccharide from a salt pan bacteriumHalolactibacillusmiurensis[J]. Carbohydrate Polymers,2017,155:400-406.

[16]Seedevi P,Moovendhan M,Viramani S,et al. Bioactive potential and structural chracterization of sulfated polysaccharide from seaweed(Gracilariacorticata)[J]. Carbohydrate Polymers,2017,155(3):516-524.

[17]李冬梅,白月娥,李玲,等. SDS-PAGE電泳法分析朝鮮族辣白菜中乳酸菌分布[J]. 食品科技,2012(11):10-13.

[18]黨麗娟,高鈺淇,別小妹,等. 60Coγ射線復合硫酸二乙酯誘變選育高產新型細菌素Plantaricin163-1菌株的研究[J]. 食品工業科技,2015,36(15):174-179.

[19]Oguma K,Katayama H,Mitani H,et al. Determination of pyrimidine dimers inEscherichiacoliandCryptosporidiumparvumduring UV light inactivation,photoreactivation,and dark repair[J]. Applied and Environmental Microbiology,2001,67(10):4630-4637.

[20]Babilas P,Schreml S,Szeimies R M,et al. Intense pulsed light(IPL):a review[J]. Lasers in Surgery & Medicine,2010,42(2):93-98.

[21]唐艷,謝芳,楊承劍,等. 水牛乳中高產胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定[J]. 中國釀造,2016,35(2):70-73.

[22]Shuhong Y,Meiping Z,Hong Y,et al. Biosorption of Cu2+,Pb2+and Cr6+by a novel exopolysaccharide fromArthrobacterps-5.[J]. Carbohydrate Polymers,2014,101(1):50-57.

[23]Chen B Y,Lung H M,Yang B B,et al. Pulsed light sterilization of packaging materials[J]. Food Packaging and Shelf Life,2015,5:1-9.

[24]Fang M,Jin L,Zhang C,et al. Rapid mutation of spirulina platensis by a new mutagenesis system of atmospheric and room temperature plasmas(ARTP)and generation of a mutant library with diverse phenotypes[J]. Plos One,2013,8(10):77-84.

[25]Anjum,Nomana,Ahmed,et al. Characterization of exopolysaccharide produced byLactobacillus;kefiranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefir-Part II[J]. Food Hydrocolloids,2013,30(1):343-350.

[26]Saravanan C,Shetty P K. Isolation and characterization of exopolysaccharide fromLeuconostoclactisKC117496 isolated from idli batter[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2016,90:100-106.

[27]Li W,Ji J,Chen X,et al. Structural elucidation and antioxidant activities of exopolysaccharides fromLactobacillushelveticus,MB2-1[J]. Carbohydrate Polymers,2014,102(1):351-359.

[28]Wang K,Li W,Rui X,et al. Characterization of a novel exopolysaccharide with antitumor activity fromLactobacillusplantarum70810[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2014,63:133-138.

[29]Jian Z,Cao Y,Ji W,et al. Physicochemical characteristics and bioactivities of the exopolysaccharide and its sulphated polymer fromStreptococcusthermophilus,GST-6[J]. Carbohydrate Polymers,2016,146:368-375.

[30]Arun J,Selvakumar S,Sathishkumar R,et al.Invitroantioxidant activities of an exopolysaccharide from a salt pan bacteriumHalolactibacillusmiurensis[J]. Carbohydrate Polymers,2017,155(2):400-405.

[31]Chen Z,Shi J,Yang X,et al. Chemical and physical characteristics and antioxidant activities of the exopolysaccharide produced by Tibetan kefir grains during milk fermentation[J]. International Dairy Journal,2015,43(107):15-21.

[32]Rani R P,Anandharaj M,Sabhapathy P,et al. Physiochemical and biological characterization of novel exopolysaccharide produced by Bacillus tequilensis FR9 isolated from chicken[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2017,96:1-10.