火龍果不同部位發酵后活性成分含量和抗氧化活性

盧冬梅,曾靖雅,潘進權,藺紅蘋,蔣 邊

(嶺南師范學院生命科學與技術學院,廣東湛江 524048)

火龍果(Hylocereusundatus)為仙人掌科(Cactaceae)植物,別名有仙蜜果、情人果、紅龍果等[1-2]。因火龍果果實呈橄欖狀果形,外表又有像蛟龍外麟的肉質鱗片,所以得名火龍果[3-4]。火龍果可分為3類,分別是紅色皮紅色肉、紅色皮白色肉、黃色皮白色肉[5]。火龍果營養豐富、功能獨特,含有一般植物少有的植物性白蛋白以及花青素,豐富的維生素和水溶性膳食纖維[6-7]。經常食用火龍果有助提高人體免疫力,不僅有降血壓、抗氧化、抗癌和預防心血管疾病等作用,還具有養膚減重、明目、護胃等作用[8-9]。

關于火龍果的研究,主要集中在火龍果不同部位營養成分的測定和評價[10-11],以及果皮天然食用色素[12]、果膠[13]、種子油[14]和黃酮化合物[15]的提取開發等,并且采用超聲波提取法[16]、微波輔助提取法[13]和亞臨界水提取法[17]等方法提取活性物質,但是火龍果發酵方面國內外研究少見報道。由于火龍果富含營養物質,經過微生物發酵后富含各種酶和酶促產物及各種營養物質,含有火龍果本身以及酵母菌發酵產生的雙重營養價值,具有很好的營養保健功能。目前火龍果發酵大部分研究是酵素產品研發[18]、果酒[19-23]、復合果酒[24-25]、復合米酒[26]、果醋[27]、低糖果脯[28]和凝固型酸奶[29]等食品發酵工藝研究,采用的主要菌種為酵母菌,但是火龍果發酵代謝產生的生物活性成分及其抗氧化活性研究比較少。董銀卯等[18]進行火龍果果實經酵母菌發酵后的產物初步研究;烏日娜等[20]研究4種不同酵母發酵的火龍果酒在發酵過程中總酚、甜菜苷、抗氧化活性和顏色的變化規律;袁星星等[23]研究了紅肉火龍果果酒發酵期間品質變化。但少有酵母菌發酵不同種類和部位火龍果的抗氧化活性及其相關性的研究。

本文分析酵母菌發酵不同種類和部位火龍果的總酚、總黃酮含量及抗氧化活性(總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力)的影響及討論酚類、黃酮類物質與抗氧化活性的相關性,為火龍果的綜合利用以及深加工提供理論依據。特別火龍果皮都作為廢棄物丟棄,造成了極大的浪費,變廢為寶,具有一定社會價值和實用意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮火龍果 廣東省湛江市市場;白砂糖 市售,為食用級;安琪葡萄酒高活性干酵母RV171 購自安琪酵母股份公司;沒食子酸(gallate acid,GA) 廣東翁江化學試劑有限公司,99%;蘆丁 美國sigma公司,98%;維生素C(VC) 廣東西隴化工有限公司,98%;鄰二氮菲和鐵氰化鉀等其他試劑 均為國產分析純。

LG16-W型離心機 北京京立離心機有限公司;UV-3000PC型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;VIS-722(N.S)型可見光分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;DZKW-C型儀表恒溫不銹鋼水浴鍋 上海新苗醫療器械制造有限公司;YXQ.SG41.280電熱手提壓力蒸汽消毒器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 選擇成熟度高、無霉爛變質及無病蟲害的新鮮火龍果,洗凈晾干后把表面的鱗片剪去。將不同種類的火龍果的不同部位(紅心火龍果果肉,red flesh,RF;白心火龍果果肉,white flesh,WF;紅心火龍果果皮,red peel,RP;白心火龍果果皮,white peel,WP)分離并切粒、打漿;通過添加25%白砂糖,10%酵母菌RV171,采用前期預實驗溫度為30 ℃下發酵4 h;發酵完成后用6層細紗布進行過濾,將過濾所得的濾汁經離心機10000 r/min離心10 min,制成火龍果不同種類和部位的發酵液,用于體外抗氧化活性測定。

1.2.2 總酚(total phenolic contents,TPC)含量的測定 采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法來測定火龍果發酵液的TPC含量[30]。1 mL樣品與1 mL福林酚試劑混勻,5 min后加3 mL質量分數20% Na2CO3溶液和5.0 mL蒸餾水充分混勻,并避光反應1.5 h,于波長765 nm處測吸光度。以GA為標準品(200～1200 mg/L)繪制標準曲線,回歸方程為y=0.0083x+0.0594,相關系數為R2=0.9935。總酚含量(mg/L)=(OD765-0.0594)×稀釋倍數/0.0083。

1.2.3 總黃酮(total flavonoid contents,TFC)含量的測定 采用Al(NO3)3-NaOH-NaNO2法測定樣品中TFC的含量[31]。0.4 mL樣品與0.3 mL質量分數5% NaNO2溶液室溫反應6 min后,加入0.3 mL質量分數10% Al(NO3)3溶液混勻后反應6 min,加入4.0 mL質量分數4% NaOH溶液和5.0 mL蒸餾水充分混勻,反應15 min后,于波長510 nm處測吸光度。以蘆丁為標準品(100～500 mg/L)繪制標準曲線,回歸方程為y=0.0015x-0.0013,相關系數為R2=0.9979。總黃酮含量(mg/L)=(OD510+0.0013)×稀釋倍數/0.0015。

1.2.4 體外抗氧化活性的測定

1.2.4.1 總抗氧化能力的測定 采用磷鉬絡合法[32]測定樣品的總抗氧化能力。試管中依次加入3 mol/L H2SO4溶液2 mL、0.14 mol/L Na3PO4溶液2 mL和0.02 mol/L鉬酸銨溶液2 mL。再加入2 mL樣品,用蒸餾水定容至10 mL,混合均勻。加塞于95 ℃水浴中加熱90 min,取出冷卻后用空白(蒸餾水代替樣品)調零在695 nm波長下測量。VC作為標準品,以吸光度(A695)為縱坐標,VC的濃度(40～120 mg/L)為橫坐標繪制標準曲線,回歸方程為y=0.0079x-0.1493,相關系數為R2=0.9941。總抗氧化能力以等量VC(mg/L)表示。總抗氧化能力(等量VC濃度mg/L)=(OD695+0.1493)×稀釋倍數/0.0079。

制備不同濃度的樣品,測定其總黃酮質量濃度和總抗氧化能力,研究不同總黃酮質量濃度對總抗氧化能力的影響。

1.2.4.2 還原能力的測定 采用普魯士藍法[33]測定樣品的還原能力。取2.5 mL不同濃度的樣品,加入0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6)2.5 mL和1% 鐵氰化鉀2.5 mL,混合均勻,于50 ℃恒溫水浴中反應20 min后急速冷卻;取出再加入10% 三氯乙酸2.5 mL。而后于3000 r/min下離心10 min,取上清液2.5 mL加入蒸餾水2.5 mL,加1 mg/L三氯化鐵0.5 mL,混勻后用分光光度計于700 nm波長處測定吸光值。以VC為標準品,繪制標準曲線。還原能力以等量VC(mg/L)表示。

取不同濃度的樣品,測定其總黃酮質量濃度和還原能力,研究不同總黃酮質量濃度對還原能力的影響。

1.2.4.3 羥基自由基清除能力的測定 參照Fenton方法[34]的方法測定樣品對羥基自由基的清除能力。精密量取2.0 mL磷酸鹽緩沖液(PBS,0.4 mol/L,pH=7.4),4.0 mL蒸餾水于試管中,作為空白參比管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)和2.0 mL蒸餾水,作為未損傷管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)、1.0 mL H2O2(0.02%)和1.0 mL蒸餾水,作為損傷管;精密量取2.0 mL PBS、3.0 mL蒸餾水和1.0 mL樣品作為樣品參比管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)、1.0 mL H2O2(0.02%)和1.0 mL樣品作為樣品管。

將上述各管置恒溫水浴鍋中,37 ℃保溫60 min,在536 nm處測定吸光值。按下式計算清除率:

羥自由基清除率(%)=[(Α樣品-Α樣參)-(Α損傷-Α空參)]/(Α未損-Α損傷)×100

式中:A樣品為樣品管的吸光度;A樣參為樣品參比管的吸光度;A空參為空白參比管的吸光度;A未損為未損傷管的吸光度;A損傷為損傷管的吸光度。

取不同濃度的樣品,測定其總黃酮質量濃度和羥基自由基清除能力,研究不同總黃酮質量濃度對羥基自由基清除能力的影響。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 總酚和總黃酮含量分析

如圖1所示,不同種類和部位火龍果發酵液總黃酮含量的變化范圍為386.64～452.42 mg/L,和白心火龍果相比,紅心火龍果具有較高的總黃酮含量,分別RP為452.42 mg/L和RF為418.87 mg/L;果皮總黃酮含量大于果肉。不同種類和部位火龍果發酵液總酚含量的變化趨勢為RP>WP>RF>WF,與WF相比，具有顯著性差異,RP發酵液中的總酚含量最高,為636.63 mg/L。與其他發酵產品相比[35],自然發酵的葡萄、桃和蘋果中,總黃酮含量分別為478.10、188.19和147.60 mg/L,總酚含量分別為710.47、323.50和217.57 mg/L。火龍果發酵后的總黃酮和總酚含量低于葡萄,明顯高于桃和蘋果。

圖1 不同種類和部位火龍果發酵液中總酚和總黃酮含量

烏日娜等[20]研究發現,酵母 RC212發酵的火龍果酒的多酚含量最高為272.5 mg/L,遠遠低于本文火龍果發酵液中的多酚含量,這可能是由于發酵條件的不同、火龍果的品種和種植環境等一系列條件的不同造成的。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 總抗氧化能力 如圖2所示,火龍果發酵液具有較強的總抗氧化能力,且不同種類和部位發酵液對總抗氧化能力不同。和白心火龍果相比,相同部位紅心火龍果具有較高的總抗氧化能力,其中RP發酵液總抗氧化能力最強,總黃酮含量為113.00 mg/L時,等量VC濃度169.32 mg/L,但是白心火龍果果皮總抗氧化能力強于紅心火龍果果肉,WP發酵液的總黃酮含量為97.00 mg/L時,等量VC濃度135.90 mg/L;果皮總抗氧化能力強于果肉。沈佩儀[33]研究發現,菠蘿皮1 g提取物相當于0.037 g VC,小于火龍果發酵液的總抗氧化能力,說明在抗氧化活性物質方面,火龍果要優于菠蘿。

圖2 不同總黃酮質量濃度的總抗氧化能力

2.2.2 還原能力 如圖3所示,不同種類和部位火龍果發酵液的還原能力具有極顯著性差異(p<0.01)。和白心火龍果相比,相同部位紅心火龍果具有較高的還原能力,其中RP發酵液還原能力最強,總黃酮含量為113.00 mg/L時,還原能力為等量VC濃度140.29 mg/L,但是白心火龍果果皮還原能力強于紅心火龍果果肉,WP發酵液的總黃酮含量為97.00 mg/L時,還原能力為等量VC濃度122.02 mg/L;果皮還原能力強于果肉。烏日娜等[20]研究發現,酵母R2發酵的火龍果酒的總還原力 IC50為28.52%,遠小于RP發酵液。可能與火龍果本身所含黃酮類、酚類物質,及發酵液中酵母菌及其代謝產物相關。

圖3 不同總黃酮質量濃度的還原能力

2.2.3 羥自由基清除能力 在氧自由基中,羥基自由基的毒性最大。醫學研究表明,羥基自由基性質十分活躍且對機體生物膜有極強的破壞力。受外界環境中諸多不良因子的影響,生物體內往往會產生過量的羥自由基,導致機體發生病理變化,從而引發多種疾病。如圖4所示,和白心火龍果相比,相同部位紅心火龍果具有較高的還原能力,其中RP發酵液和WP發酵液對羥自由基清除能力無顯著性差異(p>0.05),RP發酵液總黃酮含量為90.40 mg/L時清除率為96.65%,WP發酵液總黃酮含量為97.00 mg/L時清除率為95.87%;果皮羥基自由基能力清除強于果肉,RF和WF發酵液對羥自由基清除能力分別為88.98%和86.29%,與WF相比具有顯著性差異(p<0.05)。馬若影等[17]亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖,其羥自由基清除率可達95.15%,從比較結果可以看出亞臨界水提取和酵母菌發酵效果相當,RP發酵液具有相當強的羥自由基清除率。

圖4 不同總黃酮質量濃度對羥自由基的清除作用

董銀卯等[18]進行火龍果果實酵母菌發酵后,當濃度在50%時,清除率為47.5%;烏日娜等[20]研究發現,酵母R2發酵的火龍果酒的羥自由基清除率IC50為 8.84%,遠小于RP發酵液。

表1結果表明,RP發酵液具有較高的羥自由基清除能力,說明經酵母菌發酵可提高火龍果對羥自由基的清除作用,可能與火龍果發酵液中多酚類物質,及酵母菌的抗氧化成分和氧化還原調控系統等有關[36]。

表1 發酵前后多酚、總黃酮含量及抗氧化活性測定(以RP發酵液為例)

2.2.4 不同火龍果發酵液的體外抗氧化活性相關性分析 越來越多的研究顯示抗氧化的重要性,植物抗氧化活性已成為研究熱點。如圖2～圖4所示,在一定范圍內,隨著不同火龍果發酵液的增加,體外抗氧化活性也增加。進一步相關性分析見表2,RF發酵液與總抗氧化能力和還原能力之間呈顯著正相關,與羥自由基清除能力呈不顯著正相關;WF、RP和WP發酵液與還原能力之間呈極顯著正相關;RP和WP發酵液與總抗氧化能力之間呈極顯著正相關,與羥自由基清除能力之間呈顯著正相關;WF發酵液與羥自由基清除能力之間呈極顯著正相關,與總抗氧化能力之間呈顯著正相關。

表2 不同火龍果發酵液的體外抗氧化活性相關性分析

2.3 總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

目前很多研究表明,植物活性成分的含量、比例與抗氧化性之間存在良好的相關性。如表3所示,多酚含量與還原能力之間呈顯著正相關(r=0.967),與羥自由基清除能力呈極顯著正相關(r=0.967),與總抗氧化能力呈不顯著正相關,總黃酮含量與總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力呈不顯著正相關。相關性分析顯示,酚類物質是火龍果發酵液中主要的抗氧化成分,但黃酮不是火龍果發酵液中主要的抗氧化成分,可能是其他酚類物質如甜菜苷、鞣質等。

表3 總黃酮、總酚含量與體外抗氧化活性相關性分析

3 結論

不同種類和部位火龍果發酵液中,總黃酮含量、總酚含量和抗氧化活性不同,但都表現出濃度依賴性,隨著樣品濃度的增加而升高。其中不同發酵液中總黃酮含量變化范圍為386.64～452.42 mg/L;總酚含量為534.08～636.63 mg/L;總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力分別為104.47～169.32、67.97～140.29 mg/L和86.29%～96.65%。從火龍果不同種類發酵液來看,總黃酮含量無顯著性差異;總酚含量,紅心火龍果肉>白心火龍果肉(p<0.05);抗氧化活性,紅心火龍果>白心火龍果。從火龍果不同部位發酵液來看,總黃酮含量無顯著性差異;總酚含量:果皮>果肉;抗氧化活性:果皮>果肉。RP和WP發酵液總抗氧化能力具有極顯著性差異(p<0.01);RP、WP、RF和WF發酵液的還原能力具有極顯著性差異(p<0.01);RF和WF發酵液對羥自由基清除能力具有顯著性差異(p<0.05)。

綜上所述,紅心火龍果RP發酵液的總黃酮和總酚含量最高,總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力最強。相關性分析顯示,多酚類物質是火龍果中主要的抗氧化成分,黃酮不是火龍果發酵液中主要的抗氧化成分,但具體的火龍果發酵液中酚類物質組成和含量及其與抗氧化能力間的關系仍待進一步的研究。

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