星點設計-效應面法優化枳雀內果皮檸檬苦素提取工藝

孫小雯,彭 穎,何婉鶯,李小燕,潘思軼

(華中農業大學食品科技學院 環境食品學教育部重點實驗室,湖北武漢 430070)

枳雀是陜西省南部的一個天然品種,果皮較厚，有光滑和粗糙兩種類型,果實近球形,中心柱充實果基微凹,果頂圓且有印圈[1],其抗寒性強,可做耐寒砧木[2],果實味苦,當地人常將小果風干后磨成粉末或曬干青果作藥用。由于味苦,使枳雀成為苦味物質和功能成分研究中的重要材料[1-2]。

有研究表明,柑橘類產生苦味的主要原因之一是其含有類檸檬苦素質[3-4]。檸檬苦素具有抗癌、抗炎、抗瘧疾、抗 HIV 活性等生理活性,具有降低膽固醇、清除肺部充血性粘膜等功能[5-11]。

目前,提取檸檬苦素類的方法主要有傳統的有機溶劑提取法[4,12-15],特點是提取率高,操作簡便,但也存在溶劑殘留、污染環境等問題[14-15],常用有機溶劑有丙酮、甲醇、乙醇等。異丙苯磺酸鈉具有特定的親水-親油雙親結構,可降低細胞膜與水溶液間的界面張力,增加細胞內外濃度差,提高細胞內部系統含水量,是可提高物質的溶解能力的表面活性劑[16-19]。有報道稱,水溶助劑的助溶作用變化規律為:當水溶助劑濃度在最小助溶濃度之上時,其助溶作用幾乎呈指數上升,但水溶助劑到達一定濃度之后,其助溶作用不會再升高,且當用水溶助劑溶液被稀釋至其最小助溶濃度以下時,可回收析出的目標提取物[18-19]。劉君[17]、曾玉聰[20]等曾用水溶助劑法提取柑橘種子中的檸檬苦素,但用水溶助劑法提取枳雀中檸檬苦素的工藝研究卻鮮有報道。

本文用異丙苯磺酸鈉為水溶助劑,代替傳統的有機溶劑,以異丙苯磺酸鈉濃度、用量、浸提時間3個因素為響應因子,以檸檬苦素得率(mg/g)為響應值,優化枳雀內果皮中檸檬苦素的提取工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枳雀 產地陜西;檸檬苦素標準品 上海源葉生物科技有限公司;乙醇、異丙苯磺酸鈉、醋酸、高氯酸 國藥集團化學試劑有限公司;對二甲氨基苯甲醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

QE-100克高速萬能粉碎機 浙江屹立工貿有限公司;LGJ-18S冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司;AX124ZH電子天平 奧豪斯儀器有限公司;WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠;752E紫外分光光度計 天津冠澤科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 指示劑的制備:按冰醋酸∶高氯酸(V∶V)為5∶4的比例制得酸母液備用,按每30 mL酸母液加入1.11 g對二甲氨基苯甲醛的比例制得指示劑,指示劑現用現配[17,20]。

準確吸取0.2 mg/mL的檸檬苦素對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL,分別置于4 mL容量瓶中,用2 mol/L的異丙苯磺酸鈉溶液定容至4.0 mL,在40 ℃靜置6 h,分別取各濃度標準液2.0 mL,快速加入顯色劑和酸母液各3.0 mL,搖勻,靜置30 min,以第一試管做空白,在最大吸收波長470 nm處測定吸光度[17]。以吸光度(y)為縱坐標,檸檬苦素(x)濃度為橫坐標,繪制標準曲線,標準曲線方程為y=1.809x+0.002,R2=0.9990。

1.2.2 樣品中檸檬苦素含量測定 枳雀內果皮在-40 ℃,真空度4 Pa條件下凍干30 h并粉碎后,過40目篩,干燥保存,備用。精密稱取2.0 g枳雀內果皮粉末,在不同條件下用水溶助劑溶液提取,所得提取液定容于100 mL容量瓶中,取2.0 mL按照1.2.1所示方法進行操作,將所測樣品吸光度值帶入上述標準曲線方程,求得提取液中的檸檬苦素濃度(mg/mL),進而計算出樣品中檸檬苦素得率(mg/g)。

檸檬苦素得率(mg/g)=樣品溶液中檸檬苦素濃度×樣品溶液體積/樣品質量

1.2.3 單因素實驗 精密稱取2.0 g枳雀內果皮粉末,固定溫度為40 ℃,水溶助劑濃度2.0 mol/L,水溶助劑用量30 mL/g,提取時間6 h,分別考察不同水溶助劑濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L)、水溶助劑用量(15、20、25、30、35 mL/g)、提取時間(3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 h)對檸檬苦素提取量的影響,每組實驗重復3次,以確定各因素的恰當范圍。

1.2.4 星點實驗 根據單因素實驗結果,選取水溶助劑用量(X1)、水溶助劑濃度(X2)、提取時間(X3)3個因素做自變量,利用Design-Expert 8.0軟件,按星點設計方法設定因素水平表[21],見表1,每組實驗重復3次。

表1 星點設計因素與水平

以效應值為縱坐標,固定3個自變量之一為中值,其他兩個自變量為橫坐標,利用Design-Expert 8.0軟件繪制三維效應面圖及等高線圖。由圖中的效應值選取最佳自變量值范圍,分析得出回歸模型最大值,并用效應面法得出的最佳工藝條件提取枳雀內果皮中檸檬苦素,經驗證實驗,最終得到優化的提取工藝條件。

1.3 數據統計分析

使用Excel軟件對實驗數據進行ANOVA方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 水溶助劑用量對檸檬苦素得率的影響 由圖1可知,隨著水溶助劑用量增加,枳雀內果皮粉末與提取液的接觸面的濃度變大,水溶助劑溶液用量的增加有助于檸檬苦素的浸出,但當溶劑用量到30 mL/g之后,檸檬苦素得率穩定,說明當水溶助劑用量為30 mL/g時,檸檬苦素已基本提取完全,此時繼續增加溶劑用量,不僅會造成單位提取液中檸檬苦素含量降低,而且浪費溶劑和能源,也給后續的濃縮提純工作帶來困難[17,20],故30 mL/g為提取檸檬苦素的適宜用量。

圖1 水溶助劑用量對枳雀內果皮中檬苦素得率的影響

2.1.2 水溶助劑濃度對檸檬苦素得率的影響 由圖2可知,隨著水溶助劑濃度的增加,檸檬苦素得率先增加后略有減少,可能是水溶助劑濃度升高,提取物中非目標成分增加,可能會影響檸檬苦素純度[17],因此選擇水溶助劑2.0 mol/L為提取檸檬苦素的適宜用濃度。

圖2 水溶助劑濃度對枳雀內果皮中檸檬苦素得率的影響

2.1.3 提取時間對檸檬苦素得率的影響 由圖3可知,隨著提取時間增長,檸檬苦素提取量增加,但7.5 h以后檸檬苦素提取量穩定,提取時間延長不會引起檸檬苦素提取量的變化,故選擇7.5 h為適宜提取時間。

圖3 提取時間對枳雀內果皮中檸檬苦素得率的影響

2.2 星點實驗

2.2.1 星點設計實驗結果 根據單因素實驗結果,確定星點設計因素范圍,星點設計實驗結果如表2所示。

表2 星點實驗設計及結果

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析 以水溶助劑用量(X1)、水溶助劑濃度(X2)、提取時間(X3)為自變量,檸檬苦素得率(mg/g)為因變量,采用Design-Expert 8.0軟件對結果進行多元線性回歸和二項式擬合。

Design-Expert 8.0軟件對表2的星點設計數據進行回歸方差分析如表3所示。由表3可知:二項方程的R2=0.9526,且p<0.01,說明二項式模型的擬合度好,預測可靠性更佳。對上述二項式模型進行顯著性檢驗(見表3),p值大小可判斷各因素對檸檬苦素得率的影響,B對檸檬苦素的提取影響顯著(p<0.05)。同時,A2、B2、C2對檸檬苦素得率的影響極顯著(p<0.01),A、C一次項都不顯著(p>0.05),說明具體實驗因子對效應值得影響不是簡單的線性關系。因此,宜采用二項式模型進行擬合。結果顯示各因素對檸檬苦素得率的影響次序為:水溶助劑濃度>水溶助劑用量>提取時間。

表3 擬合二項式方差分析結果

2.2.3 效應面分析 根據二項式方程,以效應值為縱坐標,固定3個自變量之一為中值,其他兩個自變量為橫坐標,應用Design-Expert 8.0軟件繪制三維效應面圖,結果見圖4～圖6。

圖4 水溶助劑用量與濃度對檸檬苦素得率影響的效應面圖

圖5 水溶助劑用量與提取時間對檸檬苦素得率影響的效應面圖

圖6 水溶助劑濃度與提取時間對檸檬苦素得率影響的效應面圖

由圖4～圖6可以直觀的看出各因素交互作用對枳雀內果皮檸檬苦素提取量的影響,若曲線越陡峭,表明響應值對于操作條件的改變越敏感,此因素的交互作用對提取檸檬苦素的影響越大;反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對響應值的影響越小。AB、BC、AC的交互作用對枳雀內果皮檸檬苦素提取量不具有顯著性影響。

通過軟件分析,得出回歸模型的最大值點,即枳雀內果皮檸檬苦素的最佳提取工藝條件為:異丙苯磺酸鈉溶液濃度2.26 mol/L,用量27.72 mL/g,浸提7.2 h,枳雀內果皮檸檬苦素預測得率為4.37 mg/g。

2.2.4 最佳工藝條件的驗證 但考慮到實際操作及工業生產的局限性,對最佳工藝條件做如下修正:在2.3 mol/L的異丙苯磺酸鈉溶液,用量27.7 mL/g,浸提7.0 h。依此工藝條件進行五組重復驗證實驗。結果表明,枳雀內果皮中檸檬苦素平均提取量為4.32 mg/g,與擬合方程預測值4.37 mg/g偏差較小。說明用星點設計-效應面法優化得到的模型參數準確可靠,所選工藝條件重復性好,工藝優化條件可行。

依照孫崇德[22]提取方法提取了枳雀內果皮檸檬苦素,五次平行,在最佳工藝條件下,檸檬苦素平均提取量為2.54 mg/g。與之相比,本研究所得檸檬苦素提取量為4.32 mg/g,提取量大,無有機溶劑殘留,水溶助劑沒有發生化學反應可回收利用[21],此法更加適用于枳雀內果皮檸檬苦素的提取。

3 結論

本研究采用水溶助劑提取法從枳雀內果皮中提取檸檬苦素,應用星點設計—效應面法優化了枳雀內果皮中檸檬苦素的提取工藝。通過回歸分析和驗證,枳雀內果皮檸檬苦素的最佳提取條件為:水溶助劑異丙苯磺酸鈉濃度2.3 mol/L,用量27.7 mL/g,提取時間7.0 h。在此條件下,枳雀內果皮檸檬苦素的實際提取量為4.32 mg/g與理論預測值4.37 mg/g較為接近,表明采用星點設計—效應面法優化枳雀內果皮檸檬苦素提取工藝的方法準確可行。整個工藝流程簡單,操作方便,研究結果將為枳雀資源的進一步開發利用提供參考。

[1]李航. 宜昌橙及兩個地方柑橘種的資源調查與評價[D]. 武漢：華中農業大學,2015.

[2]譚志友. 《中國果樹志·柑橘卷》正式出版發行[J]. 中國南方果樹,2010,39(3):11.

[3]朱春華,李菊湘,周先艷,等. 柑橘果實中檸檬苦素及類似物功能活性研究進展[J]. 保鮮與加工,2015,15(6):78-82.

[4]王菁,鄭俊霞,蒲彪. 響應面法優化柑橘皮檸檬苦素提取工藝[J]. 食品研究與開發,2011,32(2):34-38.

[5]孟鵬. 金柑檸檬苦素類化合物的提取純化、結構鑒定及生物活性研究[D]. 福州：福建農林大學,2013.

[6]蔣俊平,袁芳,吳賓,等. 檸檬苦素類似物的研究進展綜述[J]. 中國釀造,2012,31(7):10-14.

[7]李彪,施蕊,熊智,等. 柚皮檸檬苦素的提取及其殺蟲活性研究[J]. 中國農學通報,2012,28(1):284-288.

[8]劉亮,戚向陽,董緒燕. 枳實提取物清除·OH能力及抑菌活性初探[J]. 食品科學,2009,30(3):123-126.

[9]溫靖,施英,徐玉娟,等. 柑桔果實中檸檬苦素抗炎鎮痛作用的研究[J]. 食品科學,2007,(11):515-518.

[10]羅水忠,潘利華,何建軍,等. 柑橘籽中檸檬苦素的提取與抑菌性研究[J]. 農產品加工·學刊,2006(10):105-107.

[11]Poulose SM,Harris ED. Citrus limonoids induce apoptosis in human neuroblastoma cells and have radical scavenging activity[J]. Nutrition,2005,135:870-877.

[12]張聲源,鄒浩元,楊宇輝,等. 響應面法優化金柚核中類檸檬苦素的提取工藝[J]. 食品研究與開發,2017,38(9):65-69.

[13]吳笑臣,王科軍,鐘金蓮,等. 響應面法優化臍橙渣中類檸檬苦素的提取工藝[J]. 食品科學,2012,33(16):35-39.

[14]唐韻熙,鄧放明. 椪柑核中檸檬苦素類似物提取條件優化[J]. 食品與機械,2013,29(6):162-165.

[15]汪建紅,廖立敏,王碧,等. 超聲波輔助雙水相提取檸檬皮中的檸檬苦素[J]. 天然產物研究與開發,2015,27(6):1081-1085.

[16]羅星. 表面活性劑-超聲法提取黃姜中薯蕷皂苷元的研究[D].衡陽：南華大學,2011.

[17]劉君. 柑桔種子中類檸檬苦素提取純化工藝研究[D].重慶：西南大學,2008.

[18]曾憲彪,韋寶偉,韋桂寧. 應用水溶助長劑從酸藤果中提取摁貝素[J]. 實用藥物與臨床,2014,17(11):1439-1441.

[19]劉君.幾種典型雙子表面活性劑水溶液物化行為的NMR研究[D].武漢：中國科學院武漢物理與數學研究所,2014.

[20]曾育聰,朱新貴,陳洪璋,等. 陳皮柑橘籽中檸檬苦素類物質提取工藝的比較研究[J]. 食品工業科技,2012,33(21):265-268,272.

[21]陳立江,王永杰,劉宇,等. 星點設計-效應面法優選南瓜多糖提取工藝[J]. 食品科學,2013,34(8):107-112.

[22]孫崇德,陳昆松,陳青俊,等.柑桔果實中天然檸檬苦素和諾米林的提取、鑒別與檢測[J]. 中國食品學報,2004(1):9-14.